4. Ферменты бактерий

Для осуществления процессов жизнедеятельности необходимо наличие биологических катализаторов - ферментов. Мы не ставим задачу излагать учение о ферментах, это материал курса биохимии. Поэтому здесь лишь скажем, что каждый вид микроорганизмов обладает своим, присущим только этому виду, набором ферментов. Ферментативная деятельность микроорганизмов определяет их роль в круговороте веществ, способность занимать определенную экологическую нишу в микробиогеоценозе. В то же время, определенный набор ферментов часто служит опознавательным признаком для вида микроорганизмов. Поэтому мы изучаем ферменты микроорганизмов и для использования их в промышленности, сельском хозяйств, медицине и для идентификации выделенных культур микроорганизмов, т.е. для определения их видовой принадлежности. В соответствии с этим нам нет необходимости разбирать тонкости механизма действия разных ферментов, как это изучает биохимия. Нам достаточно классифицировать ферменты микроорганизмов по субстратной специфичности, по тому, какие вещества (субстраты) и как изменяются в результате действия ферментов микроорганизмов.

Соответственно мы выделяем: протеолитические, сахаролитические, липолитические ферменты, нуклеазы и оксидо-редуктазы. Не вдаваясь в подробности, которые можно найти в учебниках, скажем лишь, что ферментативная активность микроорганизмов (бактерий) изучается путем посева на дифференциально-диагностические питательные среды.

Одни ферменты бактерий локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и органеллах клетки, их называют эндоферментами. Другие ферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют биохимические превращения питательного материала до его поступления внутрь клетки - экзоферменты. Внутриклеточные ферменты могут объединяться функционально и структурно в мультиферментные комплексы. Ряд ферментов бактерий могут быть факторами вирулентности, о чем будет речь на следующей лекции.

5. Культивирование бактерий

В естественной природе и в организме хозяина сапрофиты и паразиты самостоятельно находят себе необходимые условия для жизнедеятельности. Однако, нам часто приходится получать популяции микроорганизмов в искусственных условиях. Такие популяции мы называем культурами.

Культура микроорганизмов - это микроорганизмы, размножившиеся на питательной среде в лабораторных условиях. Мы подчеркиваем искусственный, лабораторный характер культур микроорганизмов. Популяция микроорганизмов - это совокупность живых микроорганизмов независимо от того, получена она в лаборатории или развилась в естественных условиях в организме хозяина или вне организма.

Чистая культура - культура одного вида микроорганизмов. Культура может быть смешанной, состоящей из нескольких видов микроорганизмов. Проросшая культура - чистая культура, загрязненная другим видом микроорганизмов. Наша задача - научиться получать чистые культуры бактерий и работать с ними так, чтобы сохранять чистоту выделенной культуры.

Клон - микробная популяция, полученная путем вегетативного размножения одной клетки. По определению клоновая культура должна состоять из бактерий, идентичных по генотипу и фенотипическим признакам.

Штамм - культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника. Штаммы бактерий, полученные из разных источников, могут практически не различаться, но некоторые штаммы могут иметь существенные различия. Эти различия недостаточны, чтобы считать штаммы принадлежащими к разным видам или вариантам. Но некоторые штаммы, обладающие полезными свойствами, являются объектом патентования.

Таблица 2.1. Классификация питательных сред

Вид питательной среды	Назначение питательной среды	Примеры питательных сред
Простые (основные)	Для культивирования нетребовательных микроорганизмов	МПБ, МПА
Специальные	Для культивирования требовательных микроорганизмов	Глюкозный МПБ, сывороточный МПБ, кровяной МПА, среда Китт-Тароцци
Дифференциально - диагностические	Для дифференцирования микроорганизмов по биохимическим свойствам	Среды Эндо, Левина, Гисса
Элективные	Для преимущественного накопления определенных микроорганизмов, в то время как рост остальных подавлен	Щелочная пептонная вода, среды Леффлера, Ру, Плоскирева, Мюллера
Консервирую-щие	Для сохранения жизнеспособности микроорганизмов во время транспортировки в лабораторию	Глицериновая смесь

Для роста и размножения бактерий необходимо создать следующие условия, для каждого вида бактерий - определенные:

1. Подходящая питательная среда. Требования к питательной среде: содержание необходимых питательных веществ в усваиваемой форме, определенный рН (чаще всего - слабощелочной, 7,2 - 7,6), нужная консистенция (жидкие, плотные, полужидкие среды), стерильность, по возможности - прозрачность, удобная расфасовка, экономичность. По назначению питательные среды классифицируются на 5 групп (таблица 2.1).

2. Определенные условия аэрации. В зависимости от типа дыхания бактерий им необходимо создать соответствующие условия аэрации.

3. Определенная температура. Нужные температурные условия создаются в термостатах. Подавляющее большинство патогенных бактерий относятся к мезофилам, и оптимальная температура для них равна 37 °С - температура человеческого тела. Однако, есть и исключения. Например, для возбудителей чумы и иерсиноза оптимальная температура равна 25 - 28 °С.

2. Определенные условия аэрации. В зависимости от типа дыхания бактерий им необходимо создать соответствующие условия аэрации.

3. Определенная температура. Нужные температурные условия создаются в термостатах. Подавляющее большинство патогенных бактерий относятся к мезофилам, и оптимальная температура для них равна 37 °С - температура человеческого тела. Однако, есть и исключения. Например, для возбудителей чумы и иерсиноза оптимальная температура равна 25 - 28 °С.

4. Отсутствие вредных воздействий. Рост и размножение бактерий возможны только в том случае, если нет вредных влияний на микроорганизмы. Факторы внешней среды могут губительно действовать на бактерий в такой степени, что бактерии не смогут не только размножаться, но и жить.

Губительно на бактерии действуют температура, некоторые химические вещества и излучение. Это - основные антимикробные воздействия, которые могут приводить к стерилизации (полному уничтожению всех микроорганизмов) либо к дезинфекции (уничтожению прежде всего патогенных микроорганизмов). Стерилизация достигается обработкой высокой температурой, гамма-лучами либо механическим удалением бактерий при фильтровании. Для дезинфекции используют химические дезинфектанты - фенол, лизол, производные хлора, соли тяжелых металлов. Более подробные сведения по этому вопросу студенты должны получить на практических занятиях.

Если бактериям создать указанные условия, они будут расти и размножаться. Рост бактерий - воспроизведение всех клеточных структур, ведущее к увеличению массы клетки. Размножение бактерий - увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножается поперечным делением, некоторые - почкованием, грибы - путем спорообразования. Сразу скажем, что спорообразование бактерий является не способом их размножения, а способом сохранения жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях, так как одна вегетативная форма переходит в одну спору, а спора прорастает в одну бактериальную клетку.

При размножении бактериальной клетки наиболее важные процессы происходят в ее нуклеоиде, состоящем из одной двунитевой молекулы ДНК и содержащем всю генетическую информацию клетки. Репликация (размножение) ДНК начинается в определенной точке и происходит в двух противоположных направлениях сначала на одной нити, а затем - на другой нити ДНК. Синтез дочерних нитей ДНК идет короткими фрагментами по 1 - 2 тыс. нуклеотидов, затем они сшиваются ферментом лигазой. Синтез ДНК бактерий идет по полуконсервативному типу, в результате чего образующиеся две дочерние молекулы ДНК состоят из одной материнской и одной дочерней нитей ДНК каждая.

Параллельно с репликацией ДНК идет образование поперечной межклеточной перегородки. Вначале происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны, затем между ними синтезируется пептидогликановая клеточная стенка. Параллельно идет увеличение размеров клетки, синтезируются необходимые биополимеры для органелл клетки. Затем дочерние клетки отделяются друг от друга.

Время одного цикла деления, которое называется временем генерации у разных видов бактерий различно - от 11 мин у холерного вибриона, 20 - 30 мин у большинства патогенных бактерий до 14 час у микобактерий туберкулеза. Соответственно видимый рост культуры образуется обычно через 18-20 час, а у микобактерий туберкулеза - спустя 2 - 3 недели. Конечно, время генерации зависит и от состава питательной среды, температуры и условий культивирования.

Если анализировать число живых клеток после посева бактерий на жидкую питательную среду в зависимости от времени, то можно построить кривую роста бактериальной культуры. При этом выделяют фазы роста культуры. Обычно различают 8 фаз, но нагляднее выделять 5 основных:

I - фаза адаптации или исходная стационарная фаза. В это время не происходит размножение бактерий, идет приспособление к питательной среде, иногда даже уменьшается число живых клеток за счет отмирания особей, прошедших пик своей биологической активности.

II - фаза логарифмического роста, когда идет экспоненциальное увеличение числа живых клеток за счет размножения. Логарифм концентрации живых клеток растет пропорционально времени.

III - фаза стационарного максимума. В эту фазу сохраняется примерно постоянное количество живых клеток вследствие того, что число отмерших клеток уравнивается с числом вновь образовавшихся. Культура достигает М-концентрации, максимальной концентрации. М-концентрация - величина постоянная для определенного вида бактерий в определенных условиях.

IV - фаза логарифмического отмирания, когда идет массивная гибель бактерий, логарифм их концентрации уменьшается пропорционально времени.

V - фаза покоя. Постепенно замедляется скорость отмирания бактерий, отдельные клетки сохраняют жизнеспособность какое-то время, но потом наступает полная гибель культуры. Конечно, спорообразующие бактерии могут переходить в состояние споры и сохранять жизнеспособность неопределенно долгое время.

Вызывает интерес причина отмирания бактерий. Ведь если бы одна бактериальная клетка могла беспрепятственно размножаться, то за 5 суток ее потомство выполнило бы бассейны всех морей и океанов на Земле. Обычно называют следующие причины отмирания бактерий: истощение питательной среды, особенно по лимитирующим компонентам, самоотравление популяции токсическими продуктами метаболизма, израсходование растворенного в среде кислорода. Действительно, в производственных условиях для получения более высокого накопления бактериальной массы используют глубинное культивирование в специальных реакторах, где происходит постоянное перемешивание питательной среды и ее аэрация. При культивировании в диализационных мешках, когда создаются условия для постоянной замены питательной среды и удаления шлаков за счет диффузии, также увеличивается масса получаемых бактерий.

Однако, только названными факторами нельзя в полной мере объяснить причины отмирания бактерий. Действительно, в фазе стационарного максимума имеются условия для размножения и одновременно отмирания бактерий, а во время исходной стационарной фазы происходит частичное отмирание бактерий в условиях свежей питательной среды. Попытаемся взглянуть на эту проблему с иной стороны.

Принято считать, что при прямом делении бактерий из одной материнской клетки образуются две равноценные дочерние. В этом случае верной будет теория неумирающей жизни, так как в потомстве можно будет всегда найти какие-то структуры от очень далеких предков, структуры, не синтезированные вновь, а сохранившиеся от материнской клетки. Но это противоречит фундаментальным биологическим законам о смертности всего живого.

Это противоречие снимается, если принять точку зрения некоторых исследователей, которые считают, что при делении бактерий образуются неравноценные клетки. Так, И.Малек (1954) в результате кинематографических исследований обнаружил, что при делении бактерий всегда есть «материнская» клетка, внутри которой дифференцируется новая масса живой материи, отделяющаяся затем в виде «дочерней» клетки. Материнская же клетка может повторять процесс деления несколько раз, после чего закономерно отмирает. Например, при изучении процесса деления E.coli Малек обнаружил, что из одной клетки, полученной в результате деления первичной материнской клетки, рождается 17 новых клеток, а из другой - только 8. Концепция о неравноценности «дочерних» клеток представляется вполне логичной, однако причины неравноценности еще должны быть исследованы.

Необходимо заметить, что существуют какие-то биологические законы, регулирующие численность бактериальных популяций независимо от названных факторов. Если посеять одну бактериальную клетку на питательную среду в чашке Петри, то вырастает ограниченная культура небольших размеров (несколько мм в диаметре), хотя имеется избыток питательной среды и пространства. Боле того, если посеять на жидкую питательную среду число бактерий, превышающих М-концентрацию для этого вида, то вначале вообще не происходит размножения бактерий в условиях свежей питательной среды. Идет отмирание бактерий до М-концентрации, затем поддерживается какое-то время М-концентрация и идет логарифмическое отмирание бактерий. Значит, существуют нам пока неизвестные биологические законы, регулирующие численность микробной популяции. Можно предположить, что это могут быть пока неизвестные химические вещества, выделяющиеся из бактерий и достигающие при определенном числе клеток на единицу объема концентрации, которая ингибирует инициацию деления. Предполагают и возможную роль «митогенетического излучения» клеток. Выяснение этих законов необходимо не только для понимания стратегии живого на Земле, но и для решения многих производственных и народно-хозяйственных проблем.