4. ТинкториальНые свойства бактерий

Бактериальные клетки являются полупрозрачными, слабо преломляют свет, оттого при обычных методах микроскопии в неокрашенном состоянии их тяжело выявить. Для выявления бактерий в нативных препаратах используют микроскопию в темном поле зрения, фазово-контрастную и аноптральную микроскопию, а также микроскопию в обычном световом микроскопе с опущенным конденсором. Однако эти методы исследования недостаточно информативные и имеют ограниченное применение при микробиологической диагностике. Намного больше значение имеет микроскопическое изучение предварительно убитых, а затем окрашенных бактерий. В микробиологии более часто применяют для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители. При простой окраске используют один краситель, сложные методы окраски проводятся с применением ряда красителей и других веществ в несколько этапов. Простая окраска является удобной для обзорной микроскопии, выявления формы и взаиморасположения бактерий. Сложные методы окраски позволяют выявить тонкие детали строения бактерий и провести цитохимическое исследование для выявления химических компонентов бактериальной клетки.

Разработка и использование методов окраски позволили подробно изучить морфологию бактерий, выявить структурные элементы, которые имеют дифференциальное значение и важные для идентификации бактерий, изучить отличия между бактериями в способности воспринимать красители, которая определяет так называемые тинкториальные свойства бактерий.

Тинкториальные свойства бактерий (лат. tinctura, от tingo - окрашиваю) способность к окрсаке: восприимчивость к окраске, кислото-спирто-щелочеустойчивость, равномерность окраски, метахроматичность, отношение к окраске по методу Грама.

Восприимчивость к окраске у большинства видов бактерий является высокой, они легко и быстро воспринимают окраску. Как правило, перед окраской бактерии фиксируют в пламени или химическими фиксаторами, в результате чего бактерии погибают и лучше воспринимают красители. При окраске в живом состоянии ферментные системы бактерий могут разрушать и обесцвечивать краситель, оттого прижизненное (витальное) окрашивание редко применяется в микробиологии.

Отдельные структурные элементы бактериальной клетки по-разному воспринимают красители. Споры и капсулы, которые имеют дифференциальное значение плохо воспринимают красители и не окрашиваются при обычных методах окраски. Но, их можно заметить в обычных окрашенных препаратах: спора видна как светлое тельце на фоне окрашенной цитоплазмы или ее остатков, капсула в виде светлого ореола на окрашенном фоне препарата вокруг интенсивно окрашенного тела бактерий. Разработаны и используются в диагностической практике специальные сложные методы окраски спор и капсул, с которыми студенты знакомятся на практических занятиях.

Не воспринимают окраски в обычных условиях некоторые бактерии, которые являются кислото-спирто-щелочеустойчивыми, то есть не погибают при действии растворенных кислот, щелочей и спирта. К ним относятся микобактерии туберкулеза, проказы, некоторых актиномицеты. Кислотоустойчивость этих бактерий обусловлена высоким содержанием липидов, наличием миколовых кислот и физико-химическими особенностями их клеточной стенки. У микобактерий до 40 % сухого остатка составляют липиды. Выявленные три фракции липидов: фосфатидная (растворимая в эфире), жировая (растворимая в эфире и ацетоне) и восковая (растворимая в эфире и хлороформе).В составе липидов есть различные кислотоустойчивые жирные кислоты: миколовая, туберкулостеариновая, фтионовая и др. Липиды и миколовые кислоты определяют гидрофобность клеточной поверхности, которая добавляет клетке стойкость к действию растворенных в воде токсических веществ. Ненасыщенные кислоты, которые составляют 50 % от всего количества миколовых кислот, остаются жидкими даже при низких температурах и обеспечивают эластичность оболочки, необходимую для транспорта гидрофобного субстрата. Поэтому некоторые свободноживущие сапрофитные микобактерии способны использовать гидрофобные субстраты, в частности парафины нефти. Существует зависимость между количественным содержанием миколовых кислот и степенью кислотоустойчивости. Кислотоустойчивость сохраняется только при целостности клеточной стены, появление даже небольшого дефекта стенки приводит к потере кислотоустойчивости.

Кислотоустойчивость является дифференциально-диагностическим признаком и используется для выявления и идентификации бактерий. Кислотоустойчивость бактерии окрашивают интенсивным методом – концентрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв красную окраску, кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются при обработке кислотой, щелочью или спиртом. Поэтому после окраски фуксином препарат дифференцируют 5 - 10 % серной кислотой или подкисленным спиртом и после промывания водой дополнительно окрашивают обесцвеченные кислоточувствительные микроорганизмы контрастным красителем, например метиленовым синим.

Равномерность окраски. Большинство патогенных бактерий окрашивается равномерно, причем детали внутренней структуры бактериальной клетки не оказываются. Часто видимая гомогенность окраски обусловлена тем, что краситель интенсивно связывается с оболочками клетки и маскирует окраску внутренних структур. Например, только при использовании очень разбавленных растворов кристаллвиолета удается получить избирательное окрашивание гранул волютина, в то время, как краситель в обычной концентрации дает равномерную окраску клетки. Однако, некоторые бактерии (палочки чумы) и при обычных методах окраски могут окрашиваться биполярно, в виде «английской булавки}, то есть более интенсивно по полюсам, а центр остается слабоокрашенным. Неравномерно окрашиваются также спороносные палочки, поскольку спора не проокрашивается.

Метахроматичность (греч. meta - изменение, chroma - цвет) способность окрашиваться в другой цвет, чем цвет основного красителя. Диагностическое значение имеет метахроматичность зерен волютина у коринебактерий дифтерии. При окраске метиленовым синим, толуидиновым синим гранулы волютина окрашиваются в фиолетово-красный, вишневый цвет. Обычно для выявления зерен волютина окраски проводят щелочным метиленовым синим, при этом волютин окрашивается в темно-синий, а тело клетки - в голубой цвет.

Отношение к окраске по Граму. В 1884 г. Х. Грам предложил метод окраски для выявления некоторых бактерий в тканях животных. В дальнейшем этот метод окраски распространился в микробиологии, и на отношении к окраске за Граммом основанное разделение подавляющего большинства бактерий на грациликуты (грамнегативные) и фирмикуты (грампозитивные).

Окраска по Граму заключается в том, что сначала препарат окрашивают генцианвиолетом (кристалвиолетом, метилвиолетом и др.), потом обрабатывают водным раствором йода (в виде раствора Люголя) и дифференцируют этиловым спиртом. Одни бактерии, грампозитивные, сохраняют при этом темно-фиолетовую окраску, другие, грамнегативные, обесцвечиваются спиртом и затем окрашиваются раствором фуксину в контрастный красный цвет.

Механизм окраски по Граму окончательно не выяснен. Считают, что в основе механизма окраски по Граму лежат особенности химического состава и строение клеточной стенки.

Клеточная стена грампозитивных бактерий характеризуется высоким содержанием пептидогликана (муреина), который образует толстый многослойный мешок, наличием частых поперечных пептидных связей между нитями гликана, присутствием в муреиновом слое тейхоевых кислот, малым содержанием липидов. В результате обработки спиртом происходит разбухание муреинового слоя и уменьшение диаметра пор клеточной стенки, которая приводит к снижению ее проницаемости. Поэтому комплексное соединение генцианвиолета с веществом цитоплазмы и йодом у грампозитивных бактерий хоть и растворяется в спирте, но не может выйти через клеточную стенку, и клетка сохраняет первичную окраску.

Клеточная стена грамнегативных бактерий имеет тонкий крупноячеистый слой муреина с редкими поперечными связями и содержит много липидов, которые растворяются и вымываются при обработке спиртом. Поэтому проницаемость клеточной стены, и так более высокая, чем у грампозитивных бактерий, увеличивается еще больше, и краситель легко вымывается спиртом, наступает обесцвечение грамнегативных бактерий.

Доказательством того, что в окраске по Граму основную роль играет клеточная стенка, является тот факт, что при нарушении целостности клеточной стены после обработки лизоцимом, под действием пенициллина или в результате дегенерации бактерий при старении культуры грамположительных бактерии окрашиваются грамотрицательно.

Технику различных методов окраски бактерий студенты подробно изучают на практических занятиях.

РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Протченко П.З. Загальна мікробіологія, вірусологія та імунологія. Вибрані лекції: Навч. посібник . – Одеса: Одес. Держ. мед. ун-т, 2002. – 298 с.

2. Пятк³н К. Д., Кривоше¿н Ю.С. М³кроб³олог³я. - К : Высшая школа, 1992. - 432 с.

Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. - М : Медицина, 1983. - 312 с.

3. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Борисова Л.Б. – Г. : Медицина, 1993. – 232 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник под ред. А.А.Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /ред. Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова. - М: Медицина, 1994. - 528 c.

Лекция   3. ФИЗИОЛОГИЯ бактерий