Лабораторная работа № 6

Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Занятие № 13

Тема занятия: Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Цель работы: научиться определять стадии роста и биосинтеза продуцента, т.е. определять трофофазу и идиофазу методом микроскопирования окрашенного мазка культуральной жидкости.

Задачи обучения:

• Научиться идентифицировать микроморфологические признаки продуцента в стадии роста (трофофаза) после окраски метиленовой синью;

• Научиться идентифицировать признаки продуцента в стадии биосинтеза (идиофаза);

• Уметь сравнить микроскопию двух фаз – интенсивность окраски, вид и размер клетки, наличие внутриклеточных включений, дифференциацию протоплазмы, образование спор;

• Уметь измерять объемную биомассу на разных стадиях культивирования продуцента и построить кривую роста.

Материальное обеспечение работы (Материалы и приборы)

• культуральная жидкость продуцента омомицина;

• метиленовая синь;

• предметные стекла;

• пипетки стеклянные;

• фильтровальная бумага;

• пробирки мерные.

• микроскоп;

• осветитель к микроскопу;

• центрифуга;

• газовая горелка.

Задание № 1. Исследовать динамику кривой роста продуцента с определением стадий процесса биосинтеза и сравнительной характеристикой цитохимических признаков продуцента в трофофазе и идиофазе.

Методика выполнения работы (порядок выполнения работы)

• Отбирают пробы культуральной жидкости из колбы при ее одновременном перемешивании, что позволяет отобрать среднюю пробу.

• Переносят отобранную культуральную жидкость в мерную пробирку до отметки 10 мл.

• Уравновешивают пробирки с отобранными пробами на весах.

• Центрифугирируют пробирки с отобранными пробами культуральной жидкости при 2000 об/мин в течение 10 мин. Пробирки извлекают из центрифуги только после окончательной остановки ротора.

• Определяют процентное содержание биомассы относительно всего содержимого пробирки (в начальной стадии возможно неполное исчерпание питательной среды и как результат присутствие в осадке нерастворимых компонентов среды вместе с биомассой). Отличить биомассу от компонентов среды помогает преподаватель.

• На основе полученных данных строят график; по оси абсцисс указывается время взятия пробы, по оси ординат – количество образовавшейся биомассы.

• Из колб с культуральной жидкостью с пометкой «48 ч роста» и «168 ч» роста отбирают пипеткой пробы, переносят на предметные стекла и растирают по их поверхности.

• Пробу культуральной жидкости на стекле сушат на воздухе или в пламени горелки так, чтобы стекло не перегревалось. Перегрев культуральной жидкости приведет к деформации клеток продуцента и нарушит цитологическую картину при микроскопировании.

• Высохшую пробу культуральной жидкости на стекле фиксируют в пламени горелки, направляя стекло в пламя со стороны нанесенной пробы. Проводят трижды стекло через пламя медленными движениями, после чего стекло остужают при комнатной температуре.

• Остуженное предметное стекло с нанесенной пробой помещают на специальную полочку над кристаллизатором и окрашивают метиленовой синью, нанося краситель на всю поверхность мазка и выдержав 30-60 с. По окончании окраски излишек красителя сливают на фильтровальную бумагу и промывают стекло под тонкой струей воды, при этом проба на стекле должна быть расположена с обратной стороны от струи воды и омываться лишь стекающими каплями. Промывку осуществляют до обесцвечивания стекающей воды, после чего излишки воды промокают фильтровальной бумагой, устанавливая стекло ребром. Сушат стекла на воздухе или в пламени горелки, не допуская перегревания.

• Проводят микроскопию окрашенного мазка.

• Полученные данные фиксируют в рабочем журнале; микроскопию зарисовывают и описывают; на графике роста культуры в процессе ферментации обозначают стадии культивирования. По данным микроскопии указывают трофофазу и идиофазу.