Особенности биосинтеза микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

Микроорганизмы синтезируют антибиотики при росте как на агаризованных средах, так и в условиях погружения в жидкую питательную среду. Антибиотики являются вторичными метаболитами, которые обычно образуются в ответ на пищевой дефицит. Основные факторы, влияющие на образование антибиотиков микроорганизмами: состав питательной среды и условия культивирования. Главная задача при получении антибиотика – создание условий, при которых микроорганизм быстро наработает значительную биомассу и начнет синтез антибиотиков.

В Государственном научном центре антибиотиков (Москва) с использованием математических методов были разработаны универсальные ферментационные среды для проведения поисковых работ среди бактерий, актиномицетов и грибных культур.

Состав ферментационной среды М-1 для первичного скрининга антибиотиков среди бактерий и актиномицетов, %:

• Гороховая мука – 1,5;

• сахароза – 2,1;

• крахмал – 0,85;

• NaNO₃ – 0,5;

• CaCO₃ – 0,5;

• вода водопроводная, рН от 7,2 до 7,4.

Состав ферментационной среды А-9 для грибных культур, %:

• меласса – 2,0;

• соевая мука – 2,5;

• К₂НРО₄ – 0,5;

• глицерин – 3,0;

• соль поваренная – 0,5.

Среды разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками сверху пергаментной бумагой, которую закрепляют тесьмой. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 ºС и давлении 0,8 атм. Засев колб осуществляют культурой, выросшей на плотной агаризованной среде. Микробиологическим крючком вырезают агаровый блок размером 1 см³ и переносят в колбу с ферментационной средой. Засев проводят в стерильном боксе около пламени горелки. Продуцент в жидкой питательной среде в колбах культивируют в термостатируемой комнате на качалке при 180-220 об/мин. Ферментацию для бактерий и актиномицетов обычно проводят при 28 ºС; для грибных культур – при 24 ºС (до следующего занятия).

Порядок выполнения работы

• Приготовление почвенной взвеси: взвешивают 1 г почвы, помещают в колбочку со 100 мл стерильной водопроводной воды. Встряхивают смесь на шуттеле или вортексе в течение 10 мин, затем отстаивают еще 10 мин для осаждения неразбитых комочков почвы.

• Заранее приготовленную, стерильную агаризованную среду Гаузе 1 расплавляют на водяной бане, остужают до 45-50 ⁰ С и разливают в стерильные чашки Петри.

• Готовят разведения почвенной суспензии до 10-5-10-7 в воде.

• Пробу в количестве 0,5 мл из полученного разведения наносят на поверхность агаризованной среды в 3 чашках Петри. Стерильным шпателем суспензию растирают по поверхности агара.

• Засеянные чашки помещают в термостат (инкубируют при 28 ⁰ С 14 сут).

• Проводят визуальную оценку микроорганизмов, выросших на агаризованных средах после высева различных образцов почвы (приготовлены заранее преподавателем).Оценивают разнообразие выросших микроорганизмов.

• При помощи микробиологической петли на скошенный агар в пробирки выделяют 2-3 колонии.

• Проводят оценку морфологической специфики коллекции культур микроорганизмов в пробирках.

• Готовят мазки различных культур на предметных стеклах, которые фиксируют и окрашивают метиленовой синью или по Граму.

• Готовые мазки просматривают под микроскопом.