Занятие № 3

Тема занятия: Выделение почвенных микроорганизмов как объектов для скрининга биологически активных соединений. Культивирование и изучение морфологических характеристик микроорганизмов

Цель: Освоить технику выделения отдельных колоний микроорганизмов – технику скрининга микроорганизмов. Освоить основы идентификации отдельных групп микроорганизмов.

Задачи обучения:

• Знать морфологические характеристики микроорганизмов различных классов: бактерий, кокков, актиномицетов, мицелиальных, нитчатых, дрожжевых грибов и др.

• Знать технику приготовления препаратов для микроскопирования.

• Уметь пользоваться микроскопом.

• Знать специфические особенности микроорганизмов (признаки и свойства), которые используются для их систематизации, классификации и идентификации.

• Знать технику отбора пробы из выращенной колонии для идентификации и классифицирования микроорганизмов

• Знать оптимальные условия хранения чистых культур и штаммов.

ЗАДАНИЕ 1. Ознакомиться с чашками Петри, на которых представлен высев почвенной суспензии после 2-недельного культивирования, а также описать и характеризовать колонии бактерий, актиномицетов и грибов.

Кроме того, необходимо ознакомиться с различными почвенными микроорганизмами, выращенными в чашках Петри и в пробирках на скошенном агаре. Провести сравнение грибных культур.

Задание 2. Исследовать выделенные из почвы в чистые культуры микроорганизмы с помощью микроскопа.

Задание 3. Провести посев идентифицированных и отобранных колоний микроорганизмов для получения чистой культуры

Приготовление агаризованных сред для выделения микроорганизмов

Для выделения актиномицетов используют среду Гаузе 1, содержащую (%):

• крахмал – 2,0;

• MgSO₄ × 7H₂O – 0.05;

• KCl – 0,05;

• K₂HPO₄ – 0,05;

• KNO₃ – 0,1;

• FeSO₄ × 7H₂O – 0,001;

• агар-агар – 1,5;

• дистиллированную воду с рН=7,0.

Для выделения грибов используют среду Чапека (%):

• глюкоза – 2,0;

• NaNO₃ – 0,2;

• K₂HPO₄ – 0,1;

• MgSO₄ × 7H₂O – 0.05;

• KCl – 0,05;

• FeSO₄ × 7H₂O – 0,001;

• агар-агар – 1,5;

• дистиллированная вода, рН от 6,8 до 7,2.

Для выделения бактерий используют глюкозо-дрожжевую среду, %:

• глюкоза – 2,0;

• CaCO₃ – 1,0;

• Дрожжевая вода;

• агар-агар – 1,5;

• дистиллированная вода, рН – около 7,0.

Приготовленные среды разливают по 500 мл в микробиологические матрацы, закрывают ватно-марлевыми пробками и сверху пергаментной бумагой, которую закрепляют тесьмой. Стерилизуют в автоклаве при 120 ºС, 0,8 атм в течение 30 мин.

Приготовление почвенной суспензии и высев на агаризованные среды

• Взвешивают 1 г почвы, специально отобранной в различных регионах страны и хранящейся в лаборатории в холодильнике, и вносят в колбу со стерильной водой. Колбу встряхивают на качалке или шуттеле 15-20 мин до получения равномерной суспензии и вымывания спор микроорганизмов из почвенных комочков.

• Приготовленные ранее матрацы с агаризованной средой помещают на водяную баню для расплавления среды, которую далее охлаждают до 50-70 ºС и разливают в чашки Петри по 15-20 мл при диаметра чашек 90-100 мм соответственно. Чашки с застывшим агаром помещают в стерильный бокс, немного приоткрывают крышки и подсушивают в течении 20-30 мин, чтобы избежать образования сплошного газона растущих микроорганизмов.

• Полученную суспензию спор разводят в стерильной воде от 1:10 до 1:10,8 и по капле наносят в поверхность агаризованной среды в чашки Петри. Стерильным шпателем растирают каплю по всей поверхности среды. Для выделения микроорганизмов необходимо, чтобы на одной чашке вырастало около 100 колоний, достаточно удаленных друг от друга, поэтому рабочими разведениями чаще всего являются 1:10,5-1:10,7.

• Засеянные чашки помещают в термостат. Для выделения бактерий и грибов их обычно инкубируют при 24 ºС, для выделения актиномицетов – при 28 ºС. Для выделения термотолерантных или психрофильных микроорганизмов используют специальные условия. Так, для выделения редких актиномицетов рода Micromonospora чашки инкубируют при 37 ºС 2-3 дня с последующим доращиванием в течение 7-12 сут. Такой же срок допустим для большинства культур, при этом в течение всего срока роста чашки просматривают.

Выросшие единичные колонии отсеивают в пробирки со скошенной агаризованной средой того же состава соответственно виду микроорганизма и инкубируют в термостате при оптимальной температуре. По окончании роста пробирки с культурой просматривают, отбраковывают смешанные популяции, остальные хранят в холодильнике и используют для определения биологической активности.

Методика микроскопирования (для задания 2). На предметное стекло наносят каплю стерильной воды, бактериологической петлей стерильно отбирают исследуемую культуру, суспендируют в водной капле, подсушивают на воздухе, фиксируют путем трехкратного кругового движения предметного стекла над пламенем горелки, после чего мазок готов к окрашиванию. Чаще всего используют окраску метиленовой синью. Для этого готовят насыщенный раствор красителя, который разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10 000. Полученным раствором окрашивают подготовленные мазки. Окрашивание длится 3 мин. Для удаления избытка красителя стекло с обратной стороны мазка осторожно смывают струей воды. Препарат высушивают на воздухе, после чего он готов к микроскопическому исследованию: вначале при малом увеличении, затем при большом иммерсионным маслом.

Методика окраски по Грамму. На фиксированный препарат накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают 0,01% карболовый раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин. Затем бумагу снимают и на препарат наносят раствор Люголя (раствор йода в йодистом калии), при этом образуется комплекс красителя с йодом и происходит почернение препарата. Затем препарат обесцвечивают этанолом. Комплекс красителя с йодом вымывается у микроорганизмов, имеющих клеточную мембрану, не пропускающую краситель в клетку. При дополнительном окрашивании карболовым фуксином эти культуры окрашиваются в малиновый цвет. Такие культуры получили название грамотрицательных. У грамположительных культур комплекс красителя с йодом проникает в клетку, окрашивая ее в фиолетовый цвет, который сохраняется также и при дополнительном окрашивании. Окраска по Граму очень важна при работе с бактериями.

Методика выделения чистой культуры. Наиболее широко используемым методом выделения чистой культуры является метод Дригальского, который состоит в следующем: на поверхность чашки Петри с мясо-пептонным агаром (или какой-либо другой питательной средой) наносят петлей или пастеровской пипеткой небольшую каплю исследуемого материала. Стерильным шпателем каплю тщательно растирают по всей поверхности питательной среды, после чего тем же шпателем (не беря нового материала) делают посев еще на двух чашках. В результате такого посева на поверхности третьей чашки, а иногда и на второй вырастают отдельные колонии, которые после макро- и микроскопического изучения пересевают в пробирки с питательной средой.