Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю.

Контрольные вопросы

• Какие существуют методы микробиологического контроля для определения концентрации антибиотиков?

• В чем заключается суть метода диффузии в агар?

• Какой метод определения концентрации антибиотиков считается наиболее точным и в чем заключается его сущность?

• Что такое «стандарт антибиотика» и для чего его применяют?

• Что такое «тест-микроорганизмы» («тест-микробы») и какие методы стандартизации при их применении вы знаете?

• В чем состоят принципиальные различия между определением антибиотикочувствительности и определением содержания антибиотика методом диффузии в агар?

• На каких этапах получения антибиотиков применяют микробиологические методы определения активности?

Рекомендуемая литература:

1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Изд. центр «Академия», - 2008. – 208 с.

2. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций. – Минск.: БГУ, 2002. - 105 с.

3. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология: Учебное пособие. – М.: Изд. Центр «Академия». – 2006. – 256 с.

4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к практическим занятиям. – Учебное пособие. – Под ред. акад. РАМН В.А. Быкова, проф. А.В Катлинского. – М. : ГЭОТАР-Медиа 2009. – 384 с.

5. Елинов Н.П. Химическая микробиология. - Учебник. - М.: Высшая школа. - 1989, 448 с

6. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. - Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ. - 1989, 294 с.

7. Биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир. - 1988, 480 с.

8. Чуешов В.И., Зайцев А.И., Шебанова С.Г. Промышленная технология лекарств. Том 2. Харьков, 2002.

9. Биотехнология микробного синтеза (Под ред. Бекера М.Е.) – Рига – 1980.

10. Биотехнология. /Отв. редактор А.А. Баев. - М.: Наука. - 1984, 310 с.

11. Никитин Г.А. – Биохимические основы микробиологических производств – Киев, 1981.

12. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов. М., - 1979 г.

13. Попова Т.В. – Развитие биотехнологии в СССР – М., Наука - 1988 г.

14. Промышленная микробиология (Под ред. Егорова Н.С.) – М., 1989 г.

15. Популяционные аспекты биотехнологии – Печуркин Н.С., Брильков А.В., Маркенкова Т.В. – Новосибирск: - Наука – 1990 г.

16. Процессы и аппараты химической технологии (Под ред. П.Г. Романкова). – Л. – 1981.

17. Специальные журналы: «Биотехнология», «Фармация Казахстана», «Фармация», «Фармацевтический бюллетень», и др.

Приложение к лабораторной работе № 4 (занятие № 7)

Пример расчета поправки

Средняя величина зоны подавления контрольной концентрации 1 мкг/мл равно 19,2 мм (выведено из 36 зон). Средняя величина зоны для той же концентрации, выведенная из 3 чашек, равна 19 мм. Величина поправки составляет +0,2мм. Средняя величина зоны подавления для концентрации 0,8 мкг / мл составляет 17,9 мм, после внесения поправки: 17,9 мм+0,2мм = 18,1 мм. Аналогично необходимо исправить значения величин зон для остальных концентраций, используемых при построении стандартной кривой.

Для расчета активности антибиотиков по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации на полулогарифмической сетке строят стандартную кривую, откладывая по оси абсцисс величины зон напротив значений соответствующих концентраций по оси ординат. При постоянных условиях опыта стандартной кривой можно пользоваться длительно, проверяя угол наклона кривой для каждой вновь приготовленной серии питательной среды по 2-3 концентрациям стандарта на 3-5 чашках.

При определении концентрации антибиотика в сыворотке или другом материале испытуемый субстрат разводят соответствующим растворителем до уровня, который предположительно соответствует контрольной концентрации. В зависимости от количества испытуемого материала используют одну или несколько чашек на каждое разведение. Параллельно с испытуемым материалом на каждую чашку вносят контрольную концентрацию стандартного антибиотика. После инкубации при 37 ºС в течение 16-18 ч измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором. Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в ЕД/мл или мкг/мл. Умножая полученную концентрацию на степень разведения испытуемого материала, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода составляет ± 10%.

Для выявления концентрации в испытуемом растворе можно использовать таблицы расчета активности антибиотиков. Эти таблицы содержат числовые изображение кривых, имеющих различные углы наклона. Таблицы используют в сочетании со стандартной кривой. Угол наклона каждой кривой характеризуется разностью диаметров зон на стандартной кривой при оценке концентраций, различающихся в 2 раза. Условно принимают, что антибиотик в концентрации 1 мкг/мл образует зону задержки роста диаметром 17 мм. Чтобы найти таблицу, которая соответствует углу наклона кривой, находят на кривой разность диаметров зон двух концентраций, различающихся в 2 раза. Для определения концентрации испытуемого раствора разность между средними диаметрами зон исследуемого и стандартного препарата прибавляют к 17 мм, если она положительная, и вычитывают из 17 мм, если она отрицательная. По полученной величине диаметра зон находят соответствующую концентрацию в таблице. Найденную величину умножают на количество микрограмм, содержащихся в 1 мл контрольной концентрации стандарта. Умножением этой величины на степень разведения находят содержание антибиотика в 1 мл испытуемого раствора (ГФ).

Пример расчета активности 4% раствора гентамицина по полулогарифмической сетке

Используемые величины:

контрольная концентрация гентамицина (К.к.) = 2 ЕД;

кривая с концентрацией разведения 1,2; 1,6; 2,0; 2,5; 3,0 ЕД;

1 Е/а (единица активности) = 1 мкг (для данного антибиотика);

D_max = (d₅×3 + d₄×2 + d₃ – d₁)/5,

D_min = (d₁×3 + d₂×2 + d₃ – d₅)/5

(значения D_max и D_min нужны для построения калибровочной кривой);

d₃ – среднее значение диаметров зон подавления для К.к.;

разведение опытного образца 4% раствора гентамицина до 2 ЕД, т.е. в 20 000 раз;

активность в ЕД (Х): по графику находим значение, соответствующее величине, равной d₃ + поправка для опытного образца;

концентрация в % (А) = Х × разведение опытного образца.

Таблица 2. Данные по графику

Диаметр зон подавления		Диаметр зон подавления		Диаметр зон подавления		Диаметр зон подавления
Исп.к.= 1,2	К.к. = 2,0	Исп.к.= 1,6	К.к. = 2,0	Исп.к.= 2,5	К.к. = 2,0	Исп.к.= 3,0	К.к. = 2,0
12	13,5	13	13,5	14	13,5	15	13,5
12,5	13,5	13	13	14	13,0	15	13,5
12,5	13,5	13	13,5	14	13,5	15	13,5
Средние значения диаметров зон подавления
12,3	13,5	13	13,3	14	13,3	15	13,5

Пример расчета:

d₃ = (13.5 + 13.3 + 13.3 + 13.5) /4 = 13.4

Расчет поправки:

13.4 – 13.5 = (-0.1) d₁ = 12.3 – 0.1 = 12.2;

13.4 – 13.3 = (+0.1) d₂ = 13.0 + 0.1 = 13.1;

13.4 – 13.3 = (+0.1) d₄ = 14.0 + 0.1 = 14.1;

13.4 – 13.5 = (-0.1) d₅ = 15.0 – 0.1 = 14.9;

D_max = (44,7 + 28,2 + 13.4 – 12.2) / 5 = 14.8;

D_min = (36.6 + 26.2 + 13.4 – 14.9) / 5 = 12.2.

Таблица 3. Опытные данные

Опыт 1		Опыт 2
Исп.	К.к	Исп.	К.к
13,3	13,5	13,6	13,5
13,3	13,5	13,7	13,5
13,3	13,5	13,6	13,5
13,3	13,5	13,6	13,5
-0,2		+0,1

Х₁ = d₃ + (-0.2) = 13.4 – 0.2 = 13.2, по графику соответствует 1,86 ЕД;

Х₂= d₃ + (+0.1) = 13.4 – 0.1 = 13.5, по графику соответствует 2,05 ЕД;

A₁ = 1.86 x 20 000 = 37 200 ЕД/1000 (мг) / 1000 (г) = 0,0372 г/мл х 100% = 3.7%;

А₂ = 2.05 x 20 000 = 41 000 ЕД/1000 (мг) / 1000 (г) = 0,041 г/мл х 100% = 4,1 %.

Пример расчета активности 4% раствора гентамицина по таблице

Для стандартного препарата берем три концентрации, отличающиеся в 2 раза, и по таблице находим соответствующие для них диаметры зон подавления.

0 ,75 – 11,1

1,5 – 13

13- 11,1 = 1,9

14,6 – 13 = 1,6, разрыв составляет (1,9 + 1,6) /2 = 1,8

3,0 – 14,6,

17,0 – среднее значение для стандарта (находится по таблице).

Значение поправки для опытов 1 и 2 берем из таблицы 3:

17,0 + (-0,2) = 16,8;

0,930 х 2 х 20 000 = 37 200 ЕД/1000/1000 = 0,0372 г/мл х 100 % = 3,72;

17,0 + (+0,1) = 17,1;

1,04 х 2 х 20 000 = 41 600/1000/1000 = 0,0416 г/мл х 100% = 4,16%;

Величины 0,930 и 1,04 находят по таблице.