Правила работы в биотехнологических учебных лабораториях

1. Все студенты, магистранты, ППС и УВП должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие надевают на лицо маску из марли.

2. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

3. Рабочее место должно содержаться в образцовом по­рядке. Личные вещи студентов и магистрантов следует хранить в специ­ально отведенном месте.

4. При случайном попадании микробного материала на стол, пол и пр. данное место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором.

5. Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны производиться согласно специаль­ной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов регистрируют в специальном журнале.

6. По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Аппаратура для выращивания микро­организмов, стерилизации и других микробиологических целей

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37°С. Термостаты бывают суховоздушными и водяными. Используются для культивирования микроорганизмов.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

4. Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

5. Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4°С. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С используются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура - 20°С и ниже.

6. Центрифуги. Применяются для осаждения микроорганиз­мов, эритроцитов и других клеток для разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги, работающие на разных скоростях.

7. Прибор для счета колоний. Полуавтоматический счетчик, снабженный иглой с пружинным устройством. Легкий нажим иглы на участке дна чашки Петри, соответствующей положению колонии, оставляет на стекле метку. При этом держатель поднимается вверх, цепь замыкается и показания счетчика увеличиваются на единицу.

Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют несколь­ко типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный).

Биологический микроскоп. В микробиологической практике применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, Биолам Р-1 и др. Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков различных микроорганизмов, величина которых не менее 0,2-0,3 мкм.

Предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуляром 10 составляет: 90X10-900 раз. Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу. Эти приспособления позволяют максимально использовать все его возможности, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон применений. В микробиологических лабораториях обычно используют следующие приспособления:

1. Темнопольные кардиоид- и параболоид-конденсоры.

2. Фазово-контрастное приспособление КФ-1, КФ-4 и другие модели.

3. Бинокулярная насадка, приближающая микроскопию к условиям естественного зрения.

4. Осветители ОИ-7, ОИ-19, обеспечивающие оптимальное и стабильное освещение. Интенсивность света регулируется реостатом.

5. Окуляр-микрометр и объект-микрометр, предназначенные для измерения микроскопических объектов.

6. Нагревательный столик, устанавливаемый вместо предметного столика микроскопа для обеспечения постоянной температуры 37°С и применяемый при длительном наблюдении за живыми микроорганизмами.

7. Рисовальный аппарат для зарисовки препарата, с помощью которого можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта.

8. Цветные, нейтральные и тепловые оптические светофильтры, устанавливаемые между источником света и микроскопом и применяемые при микрофотографии и при специальных методах микроскопии.

9. Микрофотонасадки МФН-1, МФН-3 и другие модели для фотографирования микроскопических объектов.

10. Микроустановка для цейтраферной (прерывистой) микро­киносъемки, в сочетании с фазово-контрастной микроскопией используемая для изучения динамики развития и размножения микроорганизмов, влияния на них разных факторов и многих других вопросов.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе.

Параболоид-конденсор имеет затемнение в центре, задерживающее централь­ные лучи света, и внутреннюю зеркальную поверхность для отражения лучей. В кардиоид-конденсоре лучи сначала отражаются от выпуклой поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, в связи с чем поле зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объекта лучи, которые образуют весьма характерное изображение ярко светящихся контуров микробных клеток и других частиц, находящихся в препарате на темном фоне.

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция (от lumen - свет) - свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: света, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция – люминесценция объекта под влиянием света. Свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждающий, поэтому возбуждают люминесценцию коротковолновыми лучами. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излучаемого света (цвет люминесценции) зависит от физико-химической структуры люминесцирующего вещества. Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями — флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследова­ния живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. Световые лучи в таких микроскопах заменяют поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т. е. почти в 100000 раз короче длины волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа, практически составляющая 0,1-0,2нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000 раз.

Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая способность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов «просвечивающего» типа.

Лабораторная работа № 1

«Выделение почвенных микроорганизмов как объектов для скрининга продуцентов биологически активных соединений. Культивирование и изучение морфологических характеристик микроорганизмов»

Занятие № 1.

Тема занятия: Приготовление плотной агаризованной среды в чашках Петри. Стерилизация среды.

Цель: Освоить метод приготовления твердой агаровой среды в чашках Петри для выделения колоний микроорганизмов как отдельных объектов.

Задачи обучения:

• Знать составы жидких, твердых и полутвердых питательных сред

• Иметь понятие о стерилизации.

• Знать виды лабораторной посуды, применяемой при приготовлении питательной среды

Для выделения из почвы и культивирования микроорганизмов проводят поэтапно следующие операции:

• Приготовление стерильных агаризованных сред, специфичных для бактерий, актиномицетов и грибов;

• Отбор почвенных проб различных регионов;

• Приготовление почвенной суспензии и высев на агаризованные среды;

• Культивирование микроорганизмов в оптимальных для разных родов и видов условиях;

• Образование штаммов чистых культур;

• Оценка морфологических и цитоморфологических характеристик выделенных культур.

ЗАДАНИЕ 1. Подобрать наиболее рациональные составы питательных сред для различных групп микроорганизмов.

ЗАДАНИЕ 2. Правильно рассчитать количественный состав по предложенной прописи и приготовить плотную питательную среду в чашке Петри, а также в пробирке со скошенной поверхностью («косяк»). Простерилизовать ее и оставить до следующего занятия.

Состав простой плотной (агаризованной) питательной среды:

Пептона 1,0

Натрия хлорида 0,5

Агара 2,0

Воды дистиллированной до 100 мл

Стерилизуют 30 минут при 120 ⁰С или 1 час при 100 ⁰С

Приготовление питательной среды. Основные среды. Порошок питательного агара вносят в определенный объем дистиллированной воды, добавляют пептон, натрия хлорид и кипятят в течение 10-15 мин, после чего разливают в чашки Петри или пробирки. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, чашки Петри закрывают стеклянными крышками и стерилизуют в автоклаве. Для приготовления скошенного питательного агара пробирки с разлитым агаром оставляют застывать в наклон­ном положении на столе.