содержат сегменты геномной ДНК, которые фланкировали провирусную ДНК в геноме хозяина. Поскольку внедрение провируса в функциональные гены или вблизи них часто вызывает мутагенный или онкогенный эффект (либо и тот и другой), анализ таких фланкирующих последовательностей можно использовать для выделения гена, определяющего данный фенотип.

5.8. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР:РАСТЕНИЯ

а. Общие положения

Растительные клетки не содержат собственных плазмид. В этом случае в качестве основы для конструирования трансформирующих векторных систем в принципе могут использоваться независимо реплицирующиеся геномы различных растительных вирусов. Такие системы были созданы на основе генома вируса мозаики цветной капусты. Однако все наиболее совершенные системы векторов растений получены на основе плазмид из семейства необычных бактериальных плазмид, носящих название pTi. Эти плазмиды образуют природную систему трансформации, с помощью которой осуществляется перенос сегментов плазмидной ДНК в геномы разнообразных двудольных растений.

В отсутствие специфического вектора прямая трансформация по крайней мере некоторых растительных клеток осуществляется с помощью трансфекции фрагментами чужеродной ДНК, добавленными в культуральную среду. Как и клетки животных, клетки растений поглощают ДНК и она интегрирует с клеточным геномом, в результате чего образуются стабильно трансформированные клетки. Однако эффективность прямой трансформации весьма низка. Отобрать трансформанты, появляющиеся с частотой примерно 1 на 106 обработанных клеток, можно лишь с помощью высокочувствительных методов. Для повышения эффективности прямого введения ДНК в клетки растений можно использовать метод электропорации. В этом случае трансформированными становятся до 1% клеток, а кроме того, такой способ можно применять в случае как однодольных, так и двудольных растений. С помощью рекомбинантных ДНК были трансформированы различные растительные клетки, в том числе клетки табака, петуньи, томатов и подсолнечника. Для трансформации часто используют протопласты, полученные путем разрушения жестких клеточных стенок с помощью целлюлазы, в результате чего клетки становятся проницаемыми для ДНК. При переносе трансфицированных протопластов в соответствующую среду клеточная стенка восстанавливается.

б. Плазмида pTi-A, индуцирующая образование опухолей

Семейство конъюгативных плазмид pTi-A обнаружено в грамотрицательных бактериях Agrobacterium tumefaciens. Замкнутые кольцевые двухцепочечные плазмиды pTi имеют размер от 150 до 250 т.п.н. и содержат разнообразные уникальные гены (рис. 5.46 и табл. 5.5). Бактерии A. tumefaciens попадают в пораженные ткани растений, а затем плазмиды проникают в растительные клетки и рекомбинируют с клеточной ДНК. В растительном геноме имеется несколько специфических сайтов интеграции. Трансформированные клетки образуют опухоли, получившие название корончатых галлов (рис. 5.47). Штаммы A. tumefaciens, утратившие плазмиду pTi, не вызывают образования корончатых галлов. Клетки, выделенные из корончатых галлов, в отличие от нормальных клеток растений быстро растут в лабораторной питательной среде даже в отсутствие гормонов роста растений. Если их привить на здоровое растение, то образуется новый галл. Иногда экспрессия опухолевого фенотипа подавляется и из клеток галла регенерируются нормальные ткани растений. В лабораторных условиях трансформацию осуществляют путем инокуляции A. tumefaciens в пораненные растительные ткани (в ткани стебля, корней или кусочков листьев) или путем совместного культивирования бактерий

Нопалиновая pTi ~ 200 т.п.н.

РИС.5.46.

Схематическое изображение генетической карты типичной нопалиновой плазмиды pTi. Участок, выделенный цветом,- сегмент Т-ДНК, встроенный в ДНК клеток корончатого галла. Некоторые из представленных на схеме генов охарактеризованы в табл. 5.5 (ген agr ответствен за чувствительность к агроцину-84). Стрелками указаны последовательности из 25 п.н. на правой и левой границах Т-ДНК. Правосторонняя последовательность необходима для интеграции Т-ДНК в растительный геном. Показано положение области ori (для репликации в A. tumefaciens).

Гены vir, экспрессируемые в клетках бактерий, существенны для переноса Т-ДНК в растительный геном. Другие гены Т-ДНК экспрессируются в растениях и ответственны за опухолевый фенотип клеток корончатого галла. Эти онкогены кодируют белки, катализирующие образование гормонов роста растений–ауксина и цитокинина.

Инсерционная трансформация с участием pTi.

Механизм инсерционной трансформации плазмидой pTi отличается от механизма трансформации других эукариотических систем, описанных в данной главе, но имеет некоторое сходство с бактериальной конъюгацией. В хромосоме A. tumefaciens закодирована информация о функциях, необходимых для прикрепления бактерий к клеткам растений. Плазмида pTi кодирует цис- и транс-функции, нужные для интеграции. Для осуществления интеграции Т-ДНК на правом ее конце должен присутствовать сегмент из 25 п.н.; переносятся только те последовательности, которые расположены слева от этой области. Подобная же последовательность встречается на левом конце Т-ДНК. По-видимому, она не требуется для интеграции, но помогает обозначить конец интегрируемой Т-ДНК. Транс-функции обеспечиваются продуктами vir-генов (рис. 5.46). Среди них имеется сайт-специфическая эндонуклеаза, которая разрезает нижнюю цепь Т-ДНК в пределах обеих пограничных последовательностей. 3'-конец ДНК pTi, ближайший к правостороннему разрезу, служит праймером для синтеза ДНК, замещающей нижнюю цепь Т-ДНК. Свободная цепь Т-ДНК переносится в растительные клетки, начиная с 5'-конца правой пограничной последовательности к 3'-концу. Механизм ее включения в случайные сайты ДНК клеток растений остается неясным.

в.Конструирование векторов рекомбинантных ДНК

сиспользованием pTi

Использование плазмид pTi в качестве вектора рекомбинантных ДНК зависит от того, можно ли встроить нужный фрагмент в область Т-ДНК, провести отбор и поддерживать рекомбинантные молекулы в клетках A. tumefaciens, с тем чтобы ввести их затем в клетки растений. Из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции в большой молекуле pTi прямое включение в нее чужеродной ДНК невозможно, но существует обычный способ встраивания генов в Т-ДНК. Сама Т-ДНК была вначале клонирована в Е. coli (с использованием плазмиды pBR322). Нужные сегменты ДНК встраивают в подходящие сайты рестрикции в Т-ДНК выделенной плазмиды и полученные рекомбинанты повторно клонируют в Е. coli (рис. 5.48). Если такие плазмиды ввести путем конъюгации в клетки A. tumefaciens,

которые уже несут плазмиду pTi дикого типа, то Т-ДНК с встроенным фрагментом перейдет в результате гомологичной рекомбинации в область Т-ДНК интактной плазмиды pTi. Отбор клеток A. tumefaciens, несущих рекомбинантные плазмиды pTi, можно осуществить, если в чужеродную ДНК включить маркирующий ген типа гена пео Е. coli. Репликация рекомбинантной плазмиды pTi в клетках A. tumefaciens и последующее инфицирование растений ведут к образованию корончатых галлов, несущих сегмент рекомбинантной Т-ДНК.

Используя те преимущества, которые дает различие между цис- и транс-функциями плазмиды,

Т-ДНК

pBR322

Клонирование в Е. coli

A. tumefaclens

Е. соli

Конъюгация

Отбор клеток срекомбинантной pTi

Инфицирование

растения

Корончатый галл

РИС.5.48.

Конструирование и использование промежуточного рТ-вектора.