6.1. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) – это вид планарной хроматографии, в котором неподвижная фаза нанесена тонким слоем на инертную подложку (стеклянную, металлическую или пластиковую), перемещение элюента происходит под действием капиллярных сил в порах между гранулами сорбента. Элюент движется вдоль сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению. Причем данное движение элюента отличается ламинарным режимом течения, который способствует наиболее эффективному разделению веществ, по сравнению, например, с колоночной хроматографией. Метод ТСХ позволяет разделять смеси веществ в аналитических и полупрепаративных количествах, устанавливать чистоту и в некоторых случаях осуществлять количественное определение компонентов.

Основные преимуществами данного вида хроматографии это простота, экономичность, доступность оборудования, экспрессность (продолжительность разделения 2-100 мин), высокая эффективность разделения, наглядность результатов разделения, простота обнаружения компонентов смеси. Другим преимуществом является дешевизна метода, так как он не требует сложного и дорого оборудования.

Тонкослойная хроматография делится на аналитическую и полупрепаративную. В данном пособии подробно будет рассмотрена только аналитическая тонкослойная хроматография.

а б

Рисунок 17. Типичный прибор для проведения тонкослойной хроматографии: а – хроматографическая камера (1) с пластинкой (2), на которую нанесена хроматографируемая смесь (3); б – хроматографическая пластинка после процесса ТСХ.

Методика проведения хроматографии:

1. Вырезается пластинка подходящего размера (в большинстве случаев для контроля реакций достаточно высоты пластинки в 5 см, а её ширина выбирается в зависимости от количества точек, в среднем по 0,5 см на точку и по 0,5 см от краев пластинки, в ряде случаев размер пластинки необходимо увеличивать). В связи с наличием так называемого «краевого эффекта», слои элюента будут двигаться по пластинке неравномерно, причем скорость подъема элюента у боковых краев пластинки будет выше чем в середине. Действие этого эффекта легко можно нивелировать диагональной подрезкой углов нижней кромки пластинки. Благодаря такой форме пластинки путь, который вынужден проходить элюент у края становиться больше его пути в центре, что в свою очередь позволяет выровнить фронт элюента.

2. Нанесение образцов на пластинку осуществляется стеклянным капилляром. Образец представляют собой раствор анализируемого вещества с концентрацией не более 5%. Обычно все точки наносятся на одну линию, она называется стартовой линией. Она должна находиться на 2-3 мм выше уровня элюента во время хроматографирования. Размер пятна нанесенного вещества должен быть максимально мал, обычно не более 1‑2 мм в диаметре. Расстояние между центрами точек не менее 5 мм. Перед началом хроматографирования нужно просушить пластинку от растворителей, нанесенных вместе с образцом.

3. В качестве элюента используют как чистые растворители, так и смеси. В качестве смесей растворителей чаще всего используют двухкомпонентные смеси, реже трехкомпонентные, четырехкомпонентные в очень редких случаях. Элюент наливают слоем 2-3 мм в герметично закрывающуюся емкость, ее называют камера для ТСХ (хроматографическая камера). Плотное закрывание камеры является необходимым условием быстрого и качественного разделения, так как не позволяет элюенту изменять состав из-за неравномерного испарения компонентов и препятствует активному испарению элюента с поверхности пластинки, тем самым ускоряя движения фронта по ней.

4. Помещают пластинку в камеру для ТСХ, когда фронтальный слой элюента достигнет расстояния 3-5 мм от верхнего края пластинки, ее достают и просушивают от элюента. Так как при определенных условиях, например, при неправильно подобранном элюенте, некоторые из компонентов анализируемой смеси по пластинке будут перемещаться с фронтальным слоем и, если этот слой выйдет за границу пластинки, то идентификация этих веществ будет невозможна. Возможные варианты элюирования в этом пособии рассматриваться не будут.

5. Идентификация зон расположения соединений на хроматограмме. Положение зоны вещества на хроматограмме характеризуется величиной R_f, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до фронтальной линии элюента. Нужно понимать, что в разных системах растворителей и на различных сорбентах значение R_f будет меняться. Идентичность хроматографического поведения даже на разных сорбентах с различными растворителями нельзя рассматривать как абсолютное доказательство структурной идентичности. Идентифицировать зоны веществ возможно несколькими способами. Для идентификации неокрашенных веществ, первым делом помещают пластинку в ультрафиолет, используют источники света с максимумами излучения в области 254 нм. Современные пластинки для ТСХ имеют слой флюорофора, что позволяет идентифицировать вещества, поглощающие ультрафиолетовый свет. Поглощают УФ-свет вещества, имеющие в своей структуре несколько сопряженных кратных связей, однако бензол очень плохо поглощает УФ-свет. При обнаружении зон, поглощающих в ультрафиолете, говорят, что эти зоны «светятся» и отмечают их прямо на пластинке мягким карандашом. Вторым делом опускают пластинку в пары йода, тем самым наблюдается окрашивание в желтый цвет зон веществ, которые сорбируют его (данное свойство отмечается практически у всех органических соединений, поэтому пары йода считаются неселективным проявителем, визуализирующим практически все вещества органической природы), но, поскольку сорбция – обратимый процесс, при небольшом нагревании пластинка снова обесцвечивается. Последним возможным вариантом в качественном анализе используют различные проявители, которые необратимо реагируют с веществами на пластинке и образуют видимые зоны. Способы количественной оценки содержания вещества в хроматографических зонах в этом пособии рассматриваться не будут.

При наличии заведомо известных образцов анализируемых соединений – свидетелей идентифицируемых веществ, на линию старта перед хроматографированием наносят раствор анализируемой смеси, раствор свидетеля вещества, а также дополнительную среднюю точку, в которую наносят как анализируемую смесь, так и раствор свидетеля совместно. Если после идентификации зон разделяемых компонентов в общей точке в зоне целевого вещества проявляется одно пятно, то, вероятнее всего, это одно и то же вещество.

В препаративной тонкослойной хроматографии концентрированный раствор разделяемой смеси (до 500 мг вещества) наносят на линию старта, просушивают пластинку и проводят хроматографию. Если невозможно идентифицировать слой целевого вещества обратимыми способами (УФ, обратимая сорбция йода), то по краям пластинки проявляют часть пластинки с обеих сторон. В зоне целевого вещества удаляют с пластинки сорбент и выделяют вещество, сорбированное на силикагеле, например экстракцией.

Для проявления отдельных типов соединений используются специальные реагенты, большинство из которых нужно использовать свежеприготовленными. Для проявления хроматограммы, наносят на неё раствор проявителя методом распыления или окунанием, затем нагревают (прожигают) пластинку, например на плитке или феном, зоны веществ становятся видимыми (окрашиваются). Наиболее распространенные проявители приведены ниже:

• Универсальными проявителями являются окислители: 10-25 %‑ный водный раствор серной кислоты, проявляет органические вещества в виде коричневых или серых пятен, является низкоселективным окислителем; 10 %‑й раствор перманганата калия в воде, проявляет вещества содержащие кратные связи, альдегиды и т.д. в виде темно-коричневых пятен без нагревания, излишки раствора смывают в проточной воде; 5-10 % раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. Пластинку необходимо нагреть, после чего зоны веществ окрасятся в зеленые или синие тона, неокисляемые вещества, оставляют светлые пятна.

• Для проявления жиров и других высших эфиров используют 0,2 %-й раствор 2,7‑дихлорфлуоресцеина. При ультрафиолетовом облучении пластинки после высушивания, появляются желтые флуоресцентные пятна на темном фоне.

• Стероиды, витамины, липиды, каротеноиды и другие алкалоиды и сложноэфирные соединения проявляются при обработке пластинки насыщенным раствором хлорида сурьмы III в хлороформе или 50 %-ным раствором хлорида сурьмы III в ледяной уксусной кислоте.

• Для проявления пятен карбоновых кислот проще всего использовать водные или водно-спиртовые растворы индикаторных красителей. Для большей заметности границы пятен, раствор индикатора слегка подщелачивают (количество щелочи зависит от силы кислот, концентрации раствора и интервала рН перехода окраски). После обработки появляются цветные пятна на цветном фоне.

• Фенольные и енольные соединения достаточно четко проявляются при обработке пластинки 0,2-2 %-ным раствором треххлористого железа в воде.

• Аминокислоты, аминосахара, аминофосфатиды и другие сложные соединения с аминогруппами появляются при обработке пластинки раствором нингидрина (для его приготовления 1 г нингидрина растворяют в 100 мл этанола и добавляют одну каплю серной кислоты). При нагревании пластинки появляются пятна различных оттенков красного (для первичных аминов) и розового или жёлтого (для замещенных аминов) цвета.

• Также для проявления аминов и некоторых аминокислот используют 2 %-й раствор анилина в этаноле. Орнитин сначала окрашивается в розовый цвет и со временем бледнеет, пролин, оксипролин, пипеколиновая кислота и саркозин окрашиваются в красный цвет, а остальные аминокислоты окрашиваются в светло-коричневый цвет.

• Альдегиды и кетоны проявляются при обработке пластинки раствором 2,4‑динитрофенилгидразина, для этого к 0,1 г 2,4-динитрофенилгидразина прибавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты, а затем добавляют к смеси 20 мл теплой воды. При нагревании пластинки появляются пятна от красного до желтого цветов.

• Для проявления углеводов рекомендуется применять анисовый альдегид. Для этого 0,5 мл анисового альдегида смешивают с 0,5 мл концентрированной серной кислоты и разбавляют 9 мл этанола. При нагревании проявляются пятна различных оттенков голубого цвета.

• Алкалоиды и органические основания определяют при помощи Реагента Драгендорфа, для его приготовления смешивают 20 мл раствора А (1 г нитрата висмута основного в 20 мл 20%-ной Н₂SO₄) и 20 мл раствора Б (10 %-ный раствор йодида калия в воде) разбавляют 40 мл 50%-ным водного раствора Н₂SO₄ . При нагревании пластинки появляются оранжевые пятна.

• Для проявления неорганических катионов используют 8-оксихинолин. Вначале выдерживают хроматограмму в парах аммиака, затем обрабатывают 0,5 %-ным раствором 8‑оксихинолина в 60 %-ном этаноле и облучают УФ. Проявляются цветные пятна.

• Для проявления ионов галогенов используют смесь нитрата серебра и флуоресцеина. В начале обрабатывают пластинку 1 %-ным раствором нитрата серебра в воде, затем 0,1 %-ным раствором флуоресцеина в этаноле.