65. Секвенирование днк.

Cеквенирование - методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот .

В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов.

метод Максама-Гилберта (основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию)

метод Сэнгера (дидезокси-метод).

Метод Сэнгера более надежен и прост в исполнении, и на практике его используют чаше.

Автоматическое секвенирование

Первым стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал 2 этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех 4-х типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

Сам метод включает следующие этапы:

1) гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером

2) ферментативный синтез ДНК

3) денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер)

4) электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов)

5) анализ результатов на радиоавтографе.

На большинстве радиоавтографов можно четко различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н. Нуклеотидная последовательность на радиоавтографе считывается снизу вверх.

66. Устройство геномов растений.

РАЗМЕР ГЕНОМА КОНКРЕТНОГО ОРГАНИЗМА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ НЕСКОЛЬКИМИ ФАКТОРАМИ

• Количеством сателлитной ДНК (40% генома риса представлено одним типом минисателлитного повтора);

• Числом мобильных генетических элементов (около половины генома человека – активные и реликтовые МГЭ);

• Частотой событий дупликации генома или его частей и последующей стабильностью ди- или полиплоидного генома;

• Количеством генов в геноме (этот фактор существенен только для прокариот).

• Размером генов (у эукариот размер генов определяется размером и количеством интронов – эти показатели значительно возрастают у высших эукариот)

• Геномы растений варьируют в очень широких пределах:

Arabidopsis thaliana – 0,13 млрд н.п., Fritallaria assyriaca – 87 млрд н.п.

Для сельскохозяйственных растений характерны очень большие геномы:

Пшеница – 12 млрд. н.п., кукуруза – 2,4 млрд. н.п., томат – 1 млрд. н.п. Правда у риса – 0,44 млрд. н.п.

Характерные особенности геномов растений:

• Гены растений компактны: содержат короткие интроны и небольшое количество экзонов. Средняя длина гена – 2,5 – 3,5 т.н.п.

• Генов много – обычно не менее 40-50 тыс (в гаплоидном геноме). 20 – 30% генов специфичны для растений. А если взять регуляторные гены – то 80% характерны только для растений. Альтернативному сплайсингу подвержена небольшая часть первичных транскриптов, поэтому количество белков ненамного превышает количество генов

• Крупные геномы насыщены транспозонами и сателлитами, расположенными преимущественно в межгенных областях

• Растения (особенно культурные) часто полиплоидны, причем полиплоидизация в ходе эволюции происходила много раз, поэтому многие гены неоднократно дублируются.

Вырожденность геномов растений

Результат многократных полиплоидизаций – присутствие в геномах растений большого количества дуплицированных генов.

Если последовательности таких паралогов, а также характер их экспрессии сходны, они могут дублировать друг друга функционально, т.е. являться вырожденными.

Вырожденность геномов растений создает серьезные препятствия для изучения функций генов.

Геномы растений насыщены повторами

Транспозоны. Множество различных семейств МГЭ, которые могут занимать значительную часть генома (от 10% у Резуховидки до 80% у кукурузы). Растительные ретротранспозоны значительно более активны, чем ДНК-транспозоны.

Сателлиты. Микро- и минисателлиты могут занимать до половины генома.

Теломерные повторы

Ценромерные повторы

Повторы генов рибосомной РНК. Копии генов 5S РНК обычно рассеены по всему геному, но особенно их много в перицентромерных участках. Гены предшественника 18S, 5,8S, и 25S рРНК организованы в тандемные повторы.