61. Гибридизация нуклеиновых кислот. Детекционные методы в молекулярной биологии.
Гибридизация – это способность одиночных цепей нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) комплементарно спариваться между собой с восстановлением двухцепочечной структуры. При этом могут образовываться как комплексы ДНК-ДНК, так и комплексы ДНК-РНК.
Рис. 1. Гибридизация нуклеиновых кислот.
А - гибридизация ДНК-ДНК; Б - гибридизация ДНК-РНК.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот может быть использован:
для нахождения числа определенных нуклеотидных последовательностей (генов) в ДНК, с высокой степенью точности позволяющей выявить один-единственный ген в клетке;
для выявления локализации определенных видов матричной РНК в клетках, что позволяет судить о дифференциальной активности генов в эмбриогенезе и процессе дифференцировки в клетках эмбриона (популярной биологической моделью в таких исследованиях являются эмбрионы плодовой мушки дрозофилы);
для выявления транскрибируемых и нетранскрибируемых последовательностей в ДНК (подобный анализ результатов гибридизации ДНК:РНК позволил У. Гилберту выявить мозаичное строение генов у эукариот, что стало одним из крупнейших открытий в молекулярной биологии).
Эксперимент проводят следующим образом:
Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий, водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.
Детекционные методы в молекулярной биологии.
Традиционное окрашивание геля
Радиоактивная маркировка и детекция
Флуоресценция на основе маркировки и детекции
Традиционное окрашивание геля:
Окрашивание серебром и Окрашивание бромистым этидием
Окрашивание серебром
Фиксация (ТХУ) → Промывание → Пропитывание раствором AgNO3 → Промывание→ Восстановление Ag+ дo Ag формамидом в присутствии Na2CO3 и Na-тиосульфата→ Фиксация уксусной кислотой
Окрашивание бромистым этидием
Бромистый этидий — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле.
Новое поколение краситилей в детекционном методе молекулярной биологии
SYBR Green I - краситель для прокраски гелей (ДНК)
Имеет:
Большую чувствительность. Предел обнаружения двухцепочечной ДНК на геле для SYBR Green I составляет 1-2 нанограмма на полосу для коротких синтетических олигонуклеотидов, до 20 пикограмм высокомолекулярной природной ДНК.
Большую специфичность в отношении двухцепочечной ДНК.
Совместимость с ферментами. SYBR Green I, будучи связанным с двухцепочечной ДНК, позволяет многим обычным рестриктазам (в том числе, Hind III и EcoR I) проявлять нормальную активность. Поэтому SYBR Green I не нужно отмывать от геля при последующей рестрикции или легировании ДНК в геле.
Большую безопасность. SYBR Green не показывает высокого уровня мутагенного действия.
SYBR Green II (РНК)
SYBR Green II окрашенных РНК флуоресцирует зеленым (максимум излучения на 521 нм)
Окрашивание с SYBR Green II не влияет на передачу РНК мембраны или последующую гибридизацию.
SYBR Green II не является избирательным для окрашивания РНК, но обладают более высоким квантовым выходом при связывании с РНК (~ 0,54), чем к двухцепочечной ДНК (~ 0,36).
SYBR золото
более широкий динамический диапазон.
Быстрое проникновение геля
Пятна и ДНК, и РНК в обычных нейтральной полиакриламидном и агарозном гелях и в денатурирующих гелях с использованием мочевины, глиоксаль или формальдегида.
может быть возбуждение в стандартном просвечивание на 300 нм.
не ингибирует большинство ферментативных реакций, кроме ПЦР. ПЦР является чувствительным к высокой концентрации красителя. Решения этой проблемы путем корректировки Mg 2+ концентрации или удаление с помощью осаждения этанолом.
очень дорогие
работает наиболее эффективно при рН 7-8,5
раствор стабильный 6 месяцев до 1 года при <= 20 ° C