57. Принцип и применение maldi и esi для анализа белков.

Использование масс-спектрометрии в протеомике не ограничивается применением только одной техно-

логии, а включает целый набор различных методических приемов,выбор которых зависит от решаемых задач.

MALDI и ESI представляют собой альтернативные способы ионизации макромолекул и имеют как достоинства, так и недостатки. Принципиальное различие этих методов заключается в том, что при MALDI образуются преимущественно однозарядные ионы), а при ESI — многозарядные. За счет образования мно-

гозарядных ионов и уменьшения значения m/z ESI позволяет проводить анализ более крупных молекул, чем MALDI, но при этом интерпретация результатов исследования более сложна

Метод MALDI

Метод MALDI основан на десорбции анализируемого вещества вместе с летучим органическим веществом (матрицей) под действием коротких мощных лазерных импульсов. Взаимодействие лазерного луча с образцом приводит к испарению небольшого участка твердого образца вместе с молекулами матрицы. Над поверхностью образца образуется высокотемпературная плазма, в которой молекулы матрицы эффективно поглощают лазерное излучение и ионизуются, после чего взаимодействуют с нейтральными молекула-

ми анализируемого вещества и передают им заряд, в основном засчет процессов протонирования/депротонирования

MALDI совместима с 2DE. Подготовка образца заключается в вырезании из геля интересующих пятен, гидролизе содержащихся белков протеазой (чаще всего трипсином), смешивании полученной смеси пептидов с матрицей в соотношении примерно 1:10000 и нанесении этого раствора на металлическую поверхность

Таким образом, данные, полученные методом MALDI, основаны на последовательности физических процессов и химических взаимодействий, которые зависят от множества параметров: природы матрицы и анализируемого вещества, соотношения между веществом и матрицей, мощности лазера, усреднения спектров

по координатам точек облучения лазером.

Метод ESI

ESI (ионизация электрораспылением) — метод получения ионов в газовой фазе из раствора. Вэтом случае ионизация происходит при непрерывном распылении раствора образца в процессе прохождения через металлический или кварцевый капилляр, на который подается высокое напряже-

ние (2,5–6 кВ). Образование ионов можно рассматривать как трехэтапный процесс (рис. 8).

1. Образование заряженных микрокапель вблизи выхода из

капилляра.

2. Быстрое уменьшение размера капель за счет испарения растворителя при их движении к противоположному электроду.По достижении критического размера, при котором силы поверхностного натяжения не могут противостоять силам кулоновского отталкивания, капли «взрываются» с образованием более мелких

капель.

3. После серии подобных фрагментаций возникают капли,содержащие только одну заряженную частицу вещества. Образовавшиеся многозарядные ионы улавливаются анализатором.На практике для получения электроспрей масс-спектров используют такие полярные и относительно летучие растворители,как вода, метанол, ацетонитрил. Для усиления процесса образования протонированных частиц к образцу часто добавляют органические кислоты, например муравьиную.

Для MALDI-масс-спектрометрии наиболее распространенным является времяпролетный масс-анализатор TOF (от англ. Time of flight), работа которого основана на том, что скорость разогнанных ионов обратно пропорциональна их массе. Ионы достигают места регистрации в порядке увеличения своей массы. Анализа-

торы такого типа получили название линейных. В масс-спектрометрах с ESI наиболее часто используют ана-

лизаторы типа ионных ловушек IT (от англ. ion trap), позволяющие сфокусировать хаотично образующиеся ионы. Принцип действия таких анализаторов основан на изменении траектории движения заряженных частиц в статическом электрическом поле, создаваемом электродами внутри ловушки.