53. Использование Ti-плазмид.

Ti-плазмиды– это плазмиды, ответственные за образование опухолей у некоторых представителей голосеменных и большинства двудольных покрытосеменных растений. Эти плазмиды обнаружены в клетках вирулентных штаммов бактерий Agrobacterium tumefaciens, вызывающих раковое заболевание растений, получившее название «корончатый галл». Они обладают способностью к неограниченному нерегулируемому росту. Когда клетки «корончатых галлов» культивируют in vitro, они растут в отсутствие специальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток.

Ti-плазмиды– кольцевые молекулы ДНК длиной до500 т. п. н.Относятся к классу конъюгативных плазмид.

После заражения растения бактериями Agrobacterium tumefaciens Ti-плазмиды проникают из бактерий в клетки растения. Далее часть их ДНК, так называемая Т-ДНК, встраивается в хромосому инфицируемого растения. В таком состоянии Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов, а также синтез ряда производных аминокислот, которые называются опинами. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерии используют в качестве источников углерода и азота.

Техника метода включает:

1. Получение штамма бактерии с векторной конструкцией

2. Перенос стерильных листовых дисков либо других растительных объектов в жидкую среду, содержащую агробактерии

3. Заражение клеток раневой поверхности эксплантов и встраивание Т-ДНК с выбранным геном

4. Перенос эксплантов на среду с антибиотиком, что приводит к избирательной гибели клеток агробактерий

5. Культивирование эксплантов на среде с фитогормонами для индукции регенерации или каллусообразования в присутствии антибиотика/гербицида для проведения селективного отбора трансформированных клеток

6. Регенерация растений

Ввиду способности A. tumefaciens трансформировать клетки растений, бактерия сейчас активно используется для привнесения генетического материала с целью генетической модификации растений. A. tumefaciens способна трансформировать как двудольныерастения, так и некоторые однодольные растения и некоторые микроскопические грибки. Поэтому были разработаны специальные векторы на основе Ti-плазмиды с удалёнными генами фитогормонов и опинов («разоруженной плазмиды») для привнесения чужеродной генетической информации в геном растений с целью получения растений с желаемыми полезными признаками.

54. Принципы анализа протеома, протеомика.

Протеомика - это новая научная дисциплина, которая занимается инвентаризацией белков и выявляет белки, ответственные за те или иные патологические процессы. Протеомика устанавливает корреляцию между набором белков, нарабатываемых в ткани или клетке, и началом или развитием болезни.

 основные проблемы протеомики

1. 1.огромное огромное разнообразие разнообразие белков белков: 30 000 : 30 000

генов генов хх 200 200 возможных возможных модификаций модификаций = =

=6 000 000 белков.

3. 3.отсутствие отсутствие полимеразной полимеразной цепной цепной

тт..ее. . невозможность невозможность размножать размножать

белки белки ии таким таким образом образом решить решить проблему проблему

низких концентраций.

2. 2. огромный огромный диапазон диапазон концентраций концентраций от

нескольких нескольких молекул молекул додо сотен сотен миллионов

В этой быстро развивающейся области основным вызовом является понимание механизма взаимодействия около 300,000 протеинов в человеческом организме. Какова потенциальная выгода установления этих механизмов? Быстрая разработка лекарственных средств и новейших методов излечения болезней, с которыми медицина боролась веками. В настоящее время большая часть работ в протеомике выполняется с использованием 2-D PAGE (двумерного гель-электрофореза на полиакриламиде). Этот метод всегда будет играть большую роль в протеомных исследованиях. Однако, объем работ, которые необходимо выполнить, требует использования методов и приборов с большими производительностями, информативностью и чувствительностью. Большинство ученых мира, работающих в области протеомики сегодня уверены, что методы, комбинирующие высокоэффективную жидкостную хроматографию и тандемную масс-спектрометрию могут обеспечить быстрый прорыв в протеомике