51. Особенности трансформации клеток растений.

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией.

Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются:

• возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип;

• возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами;

• значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Основные методы трансформации:

1.Использование Ti –плазмид (Высокоэффективная система, но применима только для двудольных растений)

Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Техника метода:

1. Получение штамма бактерии с векторной конструкцией

2. Перенос стерильных листовых дисков либо других растительных объектов в жидкую среду, содержащую агробактерии

3. Заражение клеток раневой поверхности эксплантов и встраивание Т-ДНК с выбранным геном

4. Перенос эксплантов на среду с антибиотиком, что приводит к избирательной гибели клеток агробактерий

5. Культивирование эксплантов на среде с фитогормонами для индукции регенерации или каллусообразования в присутствии антибиотика/гербицида для проведения селективного отбора трансформированных клеток

6. Регенерация растений

2. Баллистический метод. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Техника метода:

• Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4-1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной хлоридом кальция или ПЭГ, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие сжатым воздухом или гелием.

• Частицы разгоняются до скорости 300-600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, интегрируется в растительную ДНК.

• Частота трансформации повышается при использовании линейной, а не кольцевой ДНК

3. Использование векторов на основе вирусов (Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки).

4. Прямое введение генов в протопласты растений (Может использоваться для введения генов только в протопласты растительных клеток).

5. Введение ДНК с помощью микроинъекций (Имеет ограниченное применение, поскольку единовременно инъекцию можно сделать только в одну клетку).

6. Электропорация (Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы целые растения). Создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля.

7. Слияние липосом (Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы целые растения)