- •«Химия» нуклеиновых оснований и днк.
- •Общее строение и функция аминокислот и белков
- •Глюкоза — это:
- •4. Сравнительный анализ строения основных классов органических веществ клетки (нуклеионовых кислот, аминокислот, липидов и сахаров).
- •Глюкоза — это:
- •5. Сравнительный анализ функций основных классов органических веществ клетки (нуклеиновых кислот, аминокислот, липидов и сахаров).
- •7. Функции семи основных функциональных групп органических соединений.
- •9. Схема основных реакций, приводящих к синтезу функционального белка ("от гена к белку").
- •10. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белка.
- •11. Транскрипция
- •12. Общая схема реакций трансляции белков и ее регуляция.
- •13. Транскрипция: передача информации о нуклеотидной последовательности днк на уровень рнк
- •15. Транскрипция днк в рнк
- •16. Генетический код, строение гена.
- •Генетический код и его свойства
- •19. Малые рнк (микро-рнк и др.), явление рнк-интерференции и его функциональная роль.
- •20. Принципы и методы выделения рнк и днк.
- •21. Нозерн-блот и гибридизация с днк-зондами.
- •22. Требования к выделению нуклеиновых кислот.
- •23. Разница в методических подходах для выделения различных типов полинуклеотидов.
- •24. Задачи и методы очистки нуклеиновых кислот.
- •25. Методика гель-электрофореза: принцип, анализ результатов и практическое применение.
- •26. Принцип и применение полимеразной цепной реакции (пцр).
- •27. Компоненты полимеразной цепной реакции (пцр). Компоненты реакции
- •28. Дизайн праймеров для пцр.
- •29. Выбор температуры ренатурации (отжига) для пцр. Отжиг
- •30. Предотвращение загрязнения и выбор числа циклов в пцр. Денатурация
- •31. Значение концентрации магния и выбор полимеразы.
- •Клонирование генов
- •33. Пцр при помощи обратной транскриптазы (rt-pcr).
- •Применение
- •34. Оптимизирование пцр (горячий старт, гнездовой, ступенчатый пцр и др.)
- •35. Количественный анализ нуклеиновых кислот при помощи пцр.
- •Спектрофотометрический анализ
- •Кюветы для анализа
- •Кюветы малого объема
- •36. Типы хозяев (хостов) для экспрессии и клонирования генов.
- •37. Генетические вектора: организация, типы и функции.
- •46. Основные методы генетической трансформации.
- •47. Принципы конструирования генов для их экспрессии в других видах.
- •48. Химеры.
- •49. Генетические кассеты.
- •50. Использование селективных маркеров, их типы.
- •51. Особенности трансформации клеток растений.
- •52. Химическая трансформация бактерий (не уверена, что это то, что надо)
- •53. Использование Ti-плазмид.
- •54. Принципы анализа протеома, протеомика.
- •55. Основные биоинфорационные "порталы" и принципы биоинформационного анализа.
- •56. Двухмерный электрофорез и масс-спектрофотометрия при анализе белков.
- •57. Принцип и применение maldi и esi для анализа белков.
- •58. Структурный анализ белков, принципы кристаллографии и наномагнитного резонанса.
- •59. Рекомбинантные белки и белковая инженерия растений.
- •60. Основы биоинформационного анализа. Алгоритм blast. Моделирование трехмерной структуры белков.
- •61. Гибридизация нуклеиновых кислот. Детекционные методы в молекулярной биологии.
- •Традиционное окрашивание геля:
- •Радиоактивная маркировкаи детекция
- •3. Флуоресценция на основе маркировки и детекции
- •62. Визуализация нуклеиновых кислот.
- •63. Перспективы прикладного использования генно-модифицированных растений.
- •65. Секвенирование днк.
- •66. Устройство геномов растений.
Спектрофотометрический анализ
Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.
При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 cm−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 cm−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 cm−1). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего сосдества.[2]
Кюветы для анализа
Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при помощи стандартной кюветы с величиной оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.
Кюветы малого объема
Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры[3] позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.
36. Типы хозяев (хостов) для экспрессии и клонирования генов.
Известно много разных типов плазмид, которые можно использовать для экспрессии гетерологичных генов в дрожжевых клетках. Большая часть манипуляций, необходимых для конструирования плазмид и их размножения, осуществляется в E.coli. Векторы, сконструированные для осуществления эффективного белкового синтеза в E. coli, обычно происходят от pBR322 или другой высококопийной плазмиды; это необходимо для получения максимального числа матриц для транскрипции.
Экспрессирующий вектор, использующий PL-npo-мотор бактериофага X. Вектор позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с чужеродным полипептидом.
Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей
Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий рекомбинантной ДНК. Дрожжевой экспрессирующий вектор. Вектор несет в себе: 1). дрожжевую область начала репликации (ori У), взятую из дрожжевой 2мкм-плаз- миды, 2) ген 1еи2 для селекции трансформированных дрожжевых клеток, а также 3) последовательности, взятые из pBR322: ori В, обеспечивающую репликацию вектора в Е. coli, и AMP, обеспечивающую устойчивость к ампициллину (для селекции трансформированных клеток Е. coli)
Экспрессирующие векторы, используемые в клетках животных
Для экспрессии клонированных генов в клетках животных были сконструированы два типа векторов; в основе одного из них лежит геном SV40, а другого - геном папилломавируса крупного рогатого скота. Векторы на основе папилломавирусов особенно полезны для синтеза больших количеств белка, а векторы на основе SV40 используются во многих экспериментах.