- •«Химия» нуклеиновых оснований и днк.
- •Общее строение и функция аминокислот и белков
- •Глюкоза — это:
- •4. Сравнительный анализ строения основных классов органических веществ клетки (нуклеионовых кислот, аминокислот, липидов и сахаров).
- •Глюкоза — это:
- •5. Сравнительный анализ функций основных классов органических веществ клетки (нуклеиновых кислот, аминокислот, липидов и сахаров).
- •7. Функции семи основных функциональных групп органических соединений.
- •9. Схема основных реакций, приводящих к синтезу функционального белка ("от гена к белку").
- •10. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белка.
- •11. Транскрипция
- •12. Общая схема реакций трансляции белков и ее регуляция.
- •13. Транскрипция: передача информации о нуклеотидной последовательности днк на уровень рнк
- •15. Транскрипция днк в рнк
- •16. Генетический код, строение гена.
- •Генетический код и его свойства
- •19. Малые рнк (микро-рнк и др.), явление рнк-интерференции и его функциональная роль.
- •20. Принципы и методы выделения рнк и днк.
- •21. Нозерн-блот и гибридизация с днк-зондами.
- •22. Требования к выделению нуклеиновых кислот.
- •23. Разница в методических подходах для выделения различных типов полинуклеотидов.
- •24. Задачи и методы очистки нуклеиновых кислот.
- •25. Методика гель-электрофореза: принцип, анализ результатов и практическое применение.
- •26. Принцип и применение полимеразной цепной реакции (пцр).
- •27. Компоненты полимеразной цепной реакции (пцр). Компоненты реакции
- •28. Дизайн праймеров для пцр.
- •29. Выбор температуры ренатурации (отжига) для пцр. Отжиг
- •30. Предотвращение загрязнения и выбор числа циклов в пцр. Денатурация
- •31. Значение концентрации магния и выбор полимеразы.
- •Клонирование генов
- •33. Пцр при помощи обратной транскриптазы (rt-pcr).
- •Применение
- •34. Оптимизирование пцр (горячий старт, гнездовой, ступенчатый пцр и др.)
- •35. Количественный анализ нуклеиновых кислот при помощи пцр.
- •Спектрофотометрический анализ
- •Кюветы для анализа
- •Кюветы малого объема
- •36. Типы хозяев (хостов) для экспрессии и клонирования генов.
- •37. Генетические вектора: организация, типы и функции.
- •46. Основные методы генетической трансформации.
- •47. Принципы конструирования генов для их экспрессии в других видах.
- •48. Химеры.
- •49. Генетические кассеты.
- •50. Использование селективных маркеров, их типы.
- •51. Особенности трансформации клеток растений.
- •52. Химическая трансформация бактерий (не уверена, что это то, что надо)
- •53. Использование Ti-плазмид.
- •54. Принципы анализа протеома, протеомика.
- •55. Основные биоинфорационные "порталы" и принципы биоинформационного анализа.
- •56. Двухмерный электрофорез и масс-спектрофотометрия при анализе белков.
- •57. Принцип и применение maldi и esi для анализа белков.
- •58. Структурный анализ белков, принципы кристаллографии и наномагнитного резонанса.
- •59. Рекомбинантные белки и белковая инженерия растений.
- •60. Основы биоинформационного анализа. Алгоритм blast. Моделирование трехмерной структуры белков.
- •61. Гибридизация нуклеиновых кислот. Детекционные методы в молекулярной биологии.
- •Традиционное окрашивание геля:
- •Радиоактивная маркировкаи детекция
- •3. Флуоресценция на основе маркировки и детекции
- •62. Визуализация нуклеиновых кислот.
- •63. Перспективы прикладного использования генно-модифицированных растений.
- •65. Секвенирование днк.
- •66. Устройство геномов растений.
Клонирование генов
Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.
Для приготовления Т-вектора используется вектор, разрезанный рестриктазой EcoRV, дающей тупые концы. Инкубация с Taq pol. и dTTP добавляет 3'-концевую Т. Самолигирование изменяет размер тех молекул вектора, которые по каким-либо причинам не приобрели 5'-концевую Т. Размер молекул с двумя 3'-концевыми Т не изменяется и это позволяет очистить их с помощью препаративного электрофореза. Taq полимераза способна добавлять один нуклеотид к тупому концу DNA. Если доступны все четыре dNTPs она предпочитает использовать для этого dATP. Но, если предоставлен только один d(G,C,T)TP, она использует его, хоть и менее эффективно, чем dATP.
33. Пцр при помощи обратной транскриптазы (rt-pcr).
В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификацииспецифического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК).[1]
Одноцепочечную
молекулу РНК превращают в реакции
обратной транскрипции (ОТ, англ. RT,
reverse
transcription)
вкомплементарную
ДНК (cDNA)
и далее амплифицируют уже одноцепочечную
молекулу ДНК,
используя традиционную ПЦР.
RT-PCR не следует путать с ПЦР
в реальном времени (англ. Real-time
PCR, Q-PCR),
которую также иногда неверно сокращают
какRT-PCR.[2]
Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу:
1. Реакция первой цепочки:
Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C.
2. Реакция второй цепочки:
После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.
После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.[2]
Применение
ОТ-ПЦР обычно используется при изучении вируса иммунодефицита человека, так как ВИЧ является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.
Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.[3].