25. Репарация днк,её типы.

Передач наследств инф в неискажён виде — важн услов выжив организма и вида в целом.изменен в структур днк недопустимы,они ведут к мутац,блокир репликациюднк, гибель клеток. Днк подверг хим изменен в рез те воздействия уф облучен,темпират, спонтанных и индуцированных факторов среды.В ходе эволюц выработалась сист способная исправлять наруш в днк вызванные обибками репликации или повреждающми агентами среды. Это сист. Репарац. В рез те её активности на 1000 поврежден в днк только 1 приводит к мутации. Наруш в сист репарации мог привести к преждевремен старению, развит онкологии, болезням аутоимунной систем(повыш заболев раком с возрастом)

Типы репарации: 1 Прямая реп-наиб простой путь устранен поврежден в днк . задействованы спецефическ ферменты способн быстро устранять соответств повреждения восстанавлив исходную структуру нуклеотидов.

2. эксцизионная реп- удален поврежден азотист основан из днк и последующ восстановлен нормальн структуры молекулы.

26. Апоптоз — програмир клеточн смерть.(в отлич от некроза — случайн в рез те несчастно случ) Генетич запрогр. Активируется под влиян внешн или внутренних стимулов (вирусов, токсинов, клеточных онкогенов, днк поврежд агентов.) Пр. Листопад. Функция апопт: инструмент гомеостаза(поддерж постоян число клеток, их дифференцировки), оружие самозащиты организма от угрож ему и потомству опастностей. Обнаруж клет смерть можн на ранн этап эмбриогенеза при формир органов, замене 1 ткан на друг, и др прсах нормальн дифференцир и развития. Во взрослом сост участв в регуляц клеточн популяц( пр. для уничтож избытка лимфоцитов, после инфицирования), для илиминации клеток потерпевш генет поврежден или раковоперерождаются. Потеря контроля над апоптозом -патологич изменен в организме,(мож из за вирусов с антиапоптозной активностью) Вмолекуляр плане — многоэтапный процесс начин с приёма определ сигнала(на рецепторы апопт,восприним сигнал от индуктора стимулир прог клет смерти. Пр:рецепрор Fas+лиганд-запуск смерть клет инфиц вирус) и заканчив деструкцией клеточных молекул под действием литических ферментов(пр-протеаз, нуклеаз).4группы молек участв в апоптозе- каспазы(особ протеолитич ферменты),адаптерные белки(контролир активац каспаз),белки суперсемейства рецепторов некроза опухолей(ТNF) и и белк семейства Bcl-2/ В клетк подвергш апоптозу в мембран митохондр образ гиганск поры-разрыв. Апоптоз реализ с исп 2 систем:рецептор плазматич мембран, митохондриальн апотогенных факторов. При повреж днк апоптоз начин кпри накоплен белк р-53. Раковое перерожд клет связ с наруш сист апоптоза. При изуч Вич вир- белки вирус уссилив апопт. Т-лимфоцитов-истощ имун сист.

27. Методы генной инженерии.

=технолгия получен рекомбинантных днк. Ген инженер предст собой конструирование in virito функционально активных генетич структур(рек днк)=создание искусствен генетич прогр. (по АА Баеву) рожден генинжен 1972 г Берг и сотрудники .получили 1 рекоб днк(днквирусSV40+бактериофаг лямбдаdvgal. Благод генинж структур и функции любого гена и продукт его экспресс(рнк,белки) стали доступн для исслед.появ возможн изуч огромн геномов высш организм но и целенаправлен изменен их структуры, услов для создан генет трансформированных микроорг, растен, животн,способн стать продуцентами биол активн соединен(фермент гормон антибиот),-созд база для развит нов биотехнолог. Триумф в 20в. Методы исслед:1.гибридизац нуклеин к-т- благод связыв нкислот по принц комплиментарн(АТУ, ГЦ) позв выявить спецефич последоват днк и рнк,совмещать различ генетич элем.используется в цепной полимеразной р-и in virito ,(сущ 2 метода.1-коннекторный метод созд услов для гибрид продуктов рестриктац разн геном путём наращ на их концах олигонуклеотидн участков их гибридиз ведёт к образ гибрид молек днк, исп 3 фермент- 5'эндонуклеаза, терминальн нуклеотидилтрансфераза,днклигаза(этим метпол 1 рекомбин днк) 2.рестриктазно-лигазный метод-(73г Коэн)более прост. Исп 1 рестриказу типа2, даёт фрагмент рестрикции с липкими концами,гибрид меж фрамент хромос и плазмидной днк осущ без процедур наращив комплиментарн концов. После оконч гибридизац остаётся сшить полинуклеотид фрагмент с помощ днклигаз) 2расщеплен днк(рестрикция с помощ рестриктаз-эндонуклеазы бактериаль происх,служ для защит клет бактер от чужеродн днк.осуществл разрывы фосфодиэфирных связ внутри полинуклеотид цеп днк. В ген инж рестрик исп для фрагментац молекднк при созд рекомбинат геномов)для выдел ген и манипуляций с ними.3.Клонирование днк -осущ путём введен фрагментднк или их групп в быстро реплицир ген элементы(плазмиды вирусы) -возможность размножать гены в клетк бактер, дрожжей,эукар. Наиб часто размн в изуч штамах E.Coli.бактер мог приобр нов ген материал 3 путями- трансформацией(изм генотоип клетк внесен днк из культурн среды.стабильн измен генотип и фенотип клетк) коньюгацией(прямой перенос днк из клетк донора в кл реципиент с исп белков мостика возник меж клетк), трансдукция(бактериофаги вводят в днк нов генет элем).+вектор-молек днк способн переносить в клетк чужерод днк и обеспеч её амплификацию 4.определен нуклеотидн последоват(секвенирование) в клонируемом фрагменте днк, позвол определить струкуру геномов и ак последовательность кодир ими белков(методы: 1химическ секвенир-максан,гилберт 76г-основ на спец хим модифик пурин и пиримидин основан с последующ выщеплением модифицирован нуклеотид из полимерн цепи и анализом образовавш продуктов методом гель-электрофореза. 2Энзиматическ мет- 75гсангер и коулсон, анализир фрагм днк исп в качве матрицы в реакции полимеразного копиров(синтез комплимент цепднк)с помощ днк полимеразы-1 E.Coli) .5.химико-ферментативный синтез полинуклеотидов, путь прямого получ необходим гена для технолог рекомб днк(см след вопр)

28. Химический синтез гена(хим-ферментативн). - стал круп достид биоорганич хим мол биол, показал трудоёмкость эт раб,открыл путь прямого плуч необходим генов длятехнолог рекомбинантн днк, важн услов прогресс ген инженерии.

Вперв осуществл 1970г сша в лаборат ХГ Кораны. 1 ген- цистрон кодир дрожжев т-рнк^ala сост из 77 пар нуклеотид. Структур т-рнк^ala была расшифров и созданы приёмы органич синтеза, позволяющ синтезир 20 членныеолигонуклеотиды.снач осущ синтез коротких одноцепочечн олигонуклеотид, ступенчато присоед их один за другими с помощ днк-лигазы фага Т4.(+ферменты ортофосфатная групп в положен 5'на одном из сшиваем концов,олигонуклеотидкиназа фага Т4, фосфорелирующ групп 5'-ОН за счёт АТР) лигаза сшив фрагм днк на 1 цепи,а 2 цепь непрерывна. Нужн вводить синтезир нуклеотид попарно чтоб после взаимод комплиментарн област оставались концевые одноцепочечн участк=липкие концы.так образ получ крупн блоки олигонуклеотидов котор с пом днклигазы соедин в цел молек гена. Позднее были синтезир гены тирозинов супрессорн днк(207 нуклеотидов), гены гормонов инсулина, соматостатина.

Синтезир нуклеотид послед елого гена очч трудно,значит ценность предст синтез коротк участков 15-20 нуклеотид, исп в кач ве зондов гибридизации(исп в саузерн-нозерн-блоттинге,скрининге рекомбин кодон днк), в кач ве праймеров при определ нуклеотид послед по методу Сангера(анализ фрагмент днк исп в кач ве матрицы в р-и полимеразного копирования с пом полимераз1е.коли), синтетич сегменты-линкеры содерж сайты узнавания рестриктаз лигируют с фрагмент днк,встраиваемыми в векторы то значит облегчает манипулировн. С клонируемыми генами. Хим синтез полидезоксирибонуклеотидов в наст вр практически автоматизирован и проводится на установках «синтезаторах днк»

29. Перспект развит мол биол, получ биол актив соедин. Перспектив-переход к внеклет технологиям белкового синтеза.отказ от жив клет замен их «биореакторами» способ осущ избират синтез нужн белков,Сприн(делал биореакторы непрерыв действ с внеклет синтез белков) предл исп вкач ве исхож матер биотехнол биосинт белков рнк,для эт нужн быстр амплицировать индивид мрнк в бесклет сист(спомощ репликазыQбэта-быстр наращ кол во цепей рнк) рнк фага и бактер способн к рекомбинац с репликазQв, с направленным получ рекомбинативн рнк.= система мож осущ репликац,рекмбин, интенсив экспрессию в бесклет сист. Высокоочищ горм кальцитоцин и интерфероны получ с исп тольк определён мрнк.

Получ. Биол актив соед. Генети инженер открыл возможн конструир ген и легла в основу новых технолог получен биол актив соедин (гормон, рилизинг-факторы,регуляторн пептиды, интерфероны идр) тк мног из них содерж в биологич объект в ничтожных колвах и их выделен слишком трудоёмко или невозможн. Ген инженер преодолев эти трудности путём амплификации соответств генов, их клониров,экспрессии в клетк бактер и дрожж, в быстро реплицирующихся клетках многоклет организм, и этим добиваются получен значит колва физиол активн молек, пригодн для использов. Как мед препарат, пищ продукт итд. Одним из перв в ген инженерии был получ. Соматотропный гормон чел(г.роста) синтезир клетк гипофиза в норме.сост из 121 акостатк. Выделяют мрнк из клет гипофиза, осуществл синтез кднк, из неё выщепляли область кодирующ сигнальн пептид и вмест него встраивали триплет АТГ кодирующтметионин и служ сигнал нач трансляц. В белоксинтезир сист клет. К полученном гену присоединяли необходим для экспрессии регуляторные компаненты(промотер и лидирующ послед для присоед мрнк к рибосом) и включали эту конструкц в плазмиду,получали вектор молекуляр клониров.дальнейш трансформац,клониров этог вектора в бактериальн клетк. Там осущ интенсив репликация, транскрипц и трансляц -эт позвол получить необходим кол во гормона.-исп в медиц и животноводстве повыш интенсивн рост животн. Чтоб синтезир соматостатин(тормозит вычленен из гипофиз горм рост) пришлось обмануть внутриклет бактериальн протеазы(котор его разлагали) с помощью конструир химерного белка предшественника, после его выделения из клет бактерии его обрабатывали бромцианом и вычленяли соматостатин. Синтез инсулина(поджел.желез)- оч важен. Тк недост прив к диабет. В 78 г в сша хим синтез получ гены кодир ак послед зрелого гормона и осуществл их клонир а клетк E.coli. Но выход был незначителен. 1890 г из ткан чел выделили мрнкинсулина,82 г канада завершил работ по полному хим синтез гена проинсулина (у нас в 83 году), инсулин первый препарат врачебн практики создан с пом технолог рекомбинир днк. Бурн развитие привело к возникновен генно-индокринологии,(выдел релизинг фактор горм роста, кортикотропина соматокриниа-регулир рост животн) г-терапии(исправл наследств дефект путём введен в геном полноцен генов),успехи в получен биол активн пептидов.(лей-энкефалин), пептид гормон брадикинин,ангиотизин. Важен синт Интерферонов(альф(при возд на лейкоцит) бэта(пр воз на фибробласты) гамма(при возд бактер и вирусн антигенов сиинт в тлимфоцит)-факторы препятсв размнож вирус в клетк. Был трудно выдел мрнк, но смогли копир все ген 3 вид интерферон, смогли получ встраив в е.коли. Так же в клетк дрожжей и высш эукар. Альф интерфер японц получ из крови гусен тутового шелкопряд.зараж вирус ядерн полиэдроза. Ген инженер исп в ген трансформац для получен клеток и цел организм животн.трансгенные животные- ввели чужие гены, част удача случайн характера.трудно регулир экспрессию генов(вст регуляторн промотеры), могут повыш рост и выход продукт питан, прод могут исп и в медицине, в животн можн выращ органы для трансплантации чел с ингибированием отторжения.+трасген раст(дальше)