11.Методы выделения и очистки белков.

1ый этап-разрушение кл.,если раст. или микроорг.,то кл.стенки разрушают сдавливанием,форфор. ступки и кварцевый песок,для животных кл.:гомогенизация в буферной среде.

м.б. ножевой (похож на блендер,плохо что разрезает все субклеточные структуры организма)

м.б. Гомогенатор\ультразвуковыедезинтеграторы\осмотич.шок.(поместить в дистилиров. воду кл у кот внутри ph меньше.)\замораживание-оттаивание.

Адсорбция(концентрация белка(на ступке) .Очень чувствительны к хим.реагентам и тяж. мет.

1.Хелатирующий компонент ЭДТА(буфер,кот наливаем)

Этилендиаминтетраацетат.

COC-H₂C CH₂-COO

N-CH₂-CH₂-N

COO-H₂C CH₂-COO

Работать нужно в холодной комнате(+2.+4) ,чтобы не было перегрева(отведение тепла от денатурации)

2.Денатурирующий реагент.

-денатурирующий белок

Дедацил сульфат натрия(SDS)

СH₂-CH₂-OH

SH

Берет удар на себя от окислителя. И предотвращает ок-ие сульфгидрильных групп.

4.Образование пены нужно избежать,следовательно добавка ПАВ

-Таблица –монограмма

-измерять ротаторы в g(ускор.свободного падения)

Солюбелизация белка-высвобождение из ассоциированного состояния.Потом экстранировать,вынуть.

Для нее примениют детергенты:

-неионные(тритон х-100 и дезоксихалат Na)Они ослабляют,расшатывают гидрофобные взаимод.

-ионные(додецил сульфат Na)

Элюирование-вымывание(примениют буферн.можно добавить соль)

Очисткабелков.

-сначала разделение,для этого нужно опираться на разницу в рвзмере,заряде,Mr,способности связываеться,растворимости.

1ый подход к очистке.(Базируется на растворимости,высаливание,солевое растворение,широко используют)

2ой подход.(на основе размера,формы и Mr молекулы)(Диализ,гель-фильтрация,ультрацентрифугируется,SDS-ПААг ЭФ)

Диализ(кАк целофановый пакет или воронка)

Гель-фильтрация(большие мол. Выходят первыми)

3ий подход.(разделение на основе заряда белка.

1.)-ион-обменная ХГ(хроматография).1ым буфером вымываем раствор,расшатываем 1 связь.уходит №1.Берем более сильный и уходит №2.Еще сильнее и №3.

2)высокоэффективная жидкостная ХГ

3)ЭФ(гель-ЭФ,изоэлектрич.(ЭФ) фокусирование,капиллярный ЭФ)

4ый подход.(разделение с помощью специф.связывания.) 1.афинная ХГ-по сродствку.2.осождение антителами.антигены реагир.и уходят в осадок)

Очистка от низкомолекул.примесей(гель фильтрация,ультрацентрифугиров(4подхода-диализ-крестализация-обессаливание,ультрафильтрация)

12.Оценка степени очистки и Определение Mr.

Опред Mr.

-Ультрацентрифугирование.Svedberg.S=v\w² × r.(S-константа седементации(осождение) v –ск.перемещ.границы между растворителем и белком w-углова скорость ротора(рад\с) r-радиус ротора(см).)S-единица измерения(Сведберг)

Характеристика эукаротических рибосом 80 Sи прокариотич 70S

Дедоцил превращает белок в палочку и переориентирует его и создает – заряд.

Когда помещаем разн.белки и ток,то все движутся к аноду.

Мелкие движутся бустро, большие медленно. Деление главным образом по Mr,размеру и форме.

Оценка степени очистки белка.

Прверяют на гомогенность.Чтобы на хроматографии была одна полоса,на электрофорезе тоже1.Проверять как мин. На 2ух препаратах,лучше на 3-4-подходами.

1.Метод седиментационного анализа(осаждение;сущ.спец табл.:скор.ротора,ск.движения.Определяют очень точно.)

2.Электрофорез в ПААГ с SDS .

3.Гель-фильтрация.

Берем серию колебрующих белков,пропусти через сифодекс белок. K=Ve-Vo\Vs.

Ve-объем элюирования,чтобы вымыть белок из колонки.Vo-очень мало V.Vs-V внутр.растворитель внутри гранулы.K-константа.

16.Общие и специфические свойства ферментов как катализаторов. Структура ферментовФермент(Ф)(от лат.закваска)-катализа-торы реакции синтеза и катаболизма, метаболических превращений в-в. Катализатор ускоряет р-цию не просто своим присутствием, а взаимодействуя с в-вом, подвергающимся превращению. Общие: Катализаторы бывают белковые и не белковые.Фер-ты:1Не входят в состав конечных продуктов р-ции,не расходуются в процессе катализа.2Ускоряют только р-ции которые могут протекать и без них,против законов термодинамики.3Не смещают положение равновесия р-ции. Специфические сво-ва отличие Ф от катализаторов:1Ф обладают избирательной деятельностью на субстрат(узкая субстратная специфичность). 2Скорость протекания р-ции выше чем при участии хим катализаторов.3Ф-белки,есть РНК. 4Для Ф р-ций характерен100%выход продукта. 5Биокатализаторы способны регулироваться, либо ускорять,либо замедлять работу Ф. Структура Ф:Mr=от15000-до нескл мил. Бывают простые(однокомпонентный белок), сложные(двухкомпонентная белковая часть-апофермент+не белковая часть-коофермент)Коофермент+Апофермент=Холофермент.Коофермент-это не органич и органич вещ-ва, не аминокислотной природы, участвуют в катализе в составе Ф.Многие коФ являются производными витаминов.Функция коФ: 1 осуществляют контакт между Ф и Субстратом.2 Участие в катализе,как акцепторы атомов и функциональных групп. 3Стабилизация апофермента.Апофермент усиливает акт-ость небелковой части,и определяет специфичное действе Ф. например:НАД(Окисляемое вещ-во служит донором Н,а НАД акцептор).У Ф есть активный центр-область Ф-ой моле-лы в которой происходит связывание и превращение субстрата.Активный центр формируется из АК остатков находящихся в определённых участках,если смотреть по номерному остатку.

17Структура ферментов.Виды специфичности фетментов(Ф). Структура Ф:Mr=от15000-до нескл мил. Бывают простые(однокомпонентный белок), сложные(двухкомпонентная белковая часть-апофермент+не белковая часть-коофермент)Коофермент+Апофермент=Холофермент.Коофермент-это орган вещ-ва, не аминокислотной природы, участвуют в катализе в составе Ф.Многие коФ являются производными витаминов.Функция коФ: 1 осуществляют контакт между Ф и Субстратом.2 Участие в катализе,как акцепторы атомов и функциональных групп. 3Стабилизация апофермента.Апофермент усиливает акт-ость небелковой части,и определяет специфичное действе Ф. например:НАД(Окисляемое вещ-во служит донором Н,а НАД акцептор).У Ф есть активный центр-,область Ф-ой моле-лы в которой происходит связывание и превращение субстрата.Активный центр формируется из АК остатков находящихся в определённых участках,если смотреть по номерному остатку. В активном центре можно выделить субстрат-связывающий участок и каталитически активные группы Ф. К последним, напр., в подподклассе сериновых протеаз относятся функц. группы остатков серина-195, гистидина-57 и аспарагиновой к-ты-102. Кроме того, в качестве каталитически активных групп Ф. выступают группа SH цистеина, группа COOH глутаминовой к-ты, и др., а также функц. группы коферментов - никотинамидное кольцо никотинамидных коферментов , пиридоксальфосфата, тиазолиновое кольцо тиаминпирофосфата, ионы металлов ( Zn²⁺, Co²⁺, Mn²⁺) и др. Индивидуальные особенности активного центра Ф обуславливают специфичность действия Ф на субстрат.Виды спецф-сти: 1Субстратная спец-ть.Структура активного центра Ф комплементарна структуре его субстрата,данный Ф может присоединять только свой лиганд. АТФ цАМФ (Ф Аденилатциклаза)2Специфичность пути превращений.Часть функциональных групп активного центра ф имеет строение и реакционную способность,что обеспечивается хим превращение субстрата в новые вещ-ва. Каждый Ф катализирует не любое из всех возможных хим превращений субстрата,а какое-либо одно.(напр гистидаза и гистидиндекарбоксилаза имеют одинаковую субстратную специфичность,но катализируют разные превращения гистидина)3Групповая или абсолютная специфичность.Ф катализирует превращение одного субстрата,как правило однотипные превращения сходных по строению веществ(напр липаза ускоряет гидролиз жиров на глицерин и ЖК);4Стереоспецифичность.Активный центр Ф, комплементарный одному стереоизомеру,не обязательно будет комплементарен и другим стереоизомрам(напр малеиновая к-та,явл цис-изомером фумаровой кислоты ,не может быть субстратом фумаразы)

18.Коферменты нуклеотидного типа строения.Кофермент-это органические вещ-ва не АК природы,участвующие в катализе в составе Ф.КоФ-ам нуклеотидноготипа строения относятся:1Никотинамидные коФ НАД и НАДФ,НАД+2Н-НАДН+Н. обНикотинамидные К. входят в состав ряда дегидрогеназ — катализаторов ключевых окислительно-восстановительных реакций энергетического и пластического обмена. Молекула НАД представляет собой динуклеотид, построенный из аденинрибонуклеотида и никотинамидрибонуклеотида (последний отвечает за проявление каталитической активности НАД), связанных фосфоангидридным мостиком, а НАДФ имеет третий остаток фосфорной кислоты в положении 2' рибозы аденилового нуклеотида. Способность НАД и НАДФ переносить электроны и протоны от окисляемого субстрата к другому акцептору обеспечивает выполнение этими К. важной биологической функции в процессе клеточного дыханияВ организме НАД и НАДФ синтезируются из никотиновой кислоты (ниацина, или витамина РР) или никотинамида, поэтому недостаточность ниацина ведет к нарушению биосинтеза никотинамидных коферментов 2Флавиновые КоФ. Флавиновые нуклеотиды, или флавиновые К. (флавинмононуклеотид, ФМН, ; флавинадениндинуклеотид, ФАД, ), являются К. так называемых флавопротеинов  — ферментов, широко распространенных в живых клетках, принимающих участие в обмене основных классов органических соединений и играющих важную роль в процессе биологического окисления. К флавиновым К. относится рибофлавин (витамин В₂), недостаточность которого приводит к нарушению нормального функционирования флавинзависимых ферментов.3КоФ Ацилирования    Кофермент А (КоА, восстановлен-ная форма KoASH; синоним коэнзим А) — соединение аденозин-3',5'-фосфорной кислоты и b-меркаптоэтиламида пантотеновой кислоты, образующее с остатками органических кислот (R) тиоэфиры типа R—СО—SKoA. Играет роль К. в переносе и активировании кислотных остатков в реакциях ацилирования, конденсации, оксидоредукции или гидратации органических кислот. КоА участвует в клеточном дыхании, биосинтезе и окислении жирных кислот, синтезе стероидов. Для нормального синтеза КоА необходимо адекватное поступление в организм пантотеновой кислоты, входящей в состав КоА.