22.Типы ферментативных реакций.Механизмы 2-х субстратных реакций.Механизм ферментативного действия пиридоксаль-зависимого фермента аланинаминотрансферазы.

(E – фермент, AB –субстраты, CD – продукты)

Типы:1)односубстратные:а)односубстратная-двухпродуктная:АВ (1 молекула) А+В(2 продукта),б)односубстратная – однопродуктная(как пример,реакции изомеризации):А  В.

2)двухсубстратные(до 70% всех реакций): А+В  С+D (могут быть обратимыми (->) или необратимыми ( <=>,участвует другой фермент или этот же при накоплении продукта).

Механизмы 2-х субстратных реакций: делятся в зависимости от последовательности присоединения субстрата в ходе протекания реакции на: 1)механизм двойного замещения(пинг-понг механизм):E+A(входит) <=>(EA<=>E’C)(C выходит)->E’+B(B входит) <=>(E’B<=>ED)(D выходит) ->E. По типу механизма двойного замещения идут реакции периминирования – открыты Браунштейном – 1927г.

2)последовательный механизм:E+A(A входит)<=>EA+B(B входит) <=>(EAB<=>ECD)->ED(C выходит) ->E(D выходит).Таким образом оба субстрата должны соединиться и образовать тройной комплекс.

По типу последовательного механизма работают надзависимые дегидрогеназы,гликозилтрансферазы,креатинкиназа.

Реакция периминирования на примере пиридоксаль-зависимого фермента аланинаминотрансферазы (L-аланин:2-оксоглутарат аминотрансфераза,АЛТ,ALT,АлАТ): Аланинаминотрансфераза катализирует перенос аминогруппы с аланина на 2-оксоглутарат:

Коферментом аминотрансфераз служит пиридоксальфосфат – производное пиридоксина(витамина В₆).Кофермент присоединяется ковалентной связью к группе лизина.Между белком и перидоксальфосфатом есть ионные взаимодействия.

Реакции периминирования проходят в две стадии(полуреакции).Если к раствору фермента добавить только один из двух субстратов – аланин,то произойдет первая полуреакция.Аминогруппа аланина присоединяется к углероду альдаминной группы фермента: альдиминная связь между коферментом и белком заменяется на альдаминную связь между коферментом и аланином.В целом в результате этой полуреакции пиридоксальдиминфосфат превращается в пиридоксамин,а аланин – в пировиноградную кислоту:

Пиридоксальдиминфосфат-фермент (E) + аланин (А) + H₂O <=> пиридоксамин фосфат-фермент + пируват (С)

При наличии второго субстрата – 2-оксоглутаровой кислоты – произойдет вторая полуреакция:

Пиридоксоаминфосфат-фермент (E’) + 2-оксоглутарат (В) <=> Пиридоксальдиминфосфат-фермент (E) + Глутамат (D)+ H₂O.

В этой полуреакции фермент переходит в начальную форму (альдиминную) и образуется второй продукт реакции – глутамат. Таким образом, суммарный результат двух полуреакций – перенос аминогруппы с аланина на 2-оксоглутарат.

54 Катаболизм углеродного скелета ак. Кетогенные и гликогенные аминокислоты.

I Кетогенные а\к

Лейцин, лизин – только кетогенные, остальные смешанные.

Лейцин, изолейцин, триптофан -> ацетил коа -> ацетоацетил коа -> Кетоновые тела

Лизин, триптофан, тирозин, фенилаланин напрямую образуют ацетоацетил Коа-> Кетоновые тела

Оксалоацетат, фумарт, СукцинилКоА и α-кетоглуторат интермедиаты цикла Кребса

15. Способы количественного определения белка. Методы определения общего белка сыворотки крови и мочи.

1. Спектрометрия - свет поглощается за счет присутствия в составе белка ароматических АК. Используется для определения концентрации индивидуального белка, без примесей (особенно, нуклеиновых кислот). Формула Калькара: С (г/л) = 1,55А(280) – 0,75А(260), где А – абсорбция

2. Колориметрия – основана на способности белков образовывать цветные комплексы с реактивами, имеющими хромофорные свойства (хромофор – молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света: -N=N; =C=; -N=S; -N=O; -C=C- и т.д.)

   1. Биуретовый метод – белок в ЩЕЛОЧНОЙ СРЕДЕ обр. с Cu2+ соединение, окраш. в сине-фиолетовый цвет: «медно-белковый комплекс». Такая реакция предполагает, что белки имеют не меньше 3х пептидных связей. Для стабилизации реагента (предотвращение ОВР) вводят KI.

   2. Метод Лоури (годится для белков в естественных средах. имеющих примесные соединения).

   3. Взаимодействие аминогруппы с различными реагентами (напр., с тринитробензолсульфокислотой).

3. Методы, основанные на специфической сорбции некоторых красителей поверхностью белковой молекулы. Красители фиксируются за счет ионных связей (предпочтит. кислое значение). Могут быть и ковалентные варианты взаимодействия.

   1. Амидовый черный

   2. Кумасси бриллиантовый синий G250 или R280

   3. Понсо S (ярко-красный)

   4. Бромфеноловый синий

Способы количественного определения белка в сыворотке крови и моче.

1. Азтометрический метод – определение белкового азота: выжигание органического соединения, а затем расчет остаточного азота. Метод относительно точный.

2. Гравиметрический – работа с осадками

   1. Центрифугирование (многократное)

   2. Отмывание (многократное)

3. Рефрактометр – определение уровня белка по показателю преломления (если сыворотка относительно здорового человека; гемолизированная сыворотка = разрушенные эритроциты, хилёзная сыворотка = избыток жиров, эктеричная св-ка = гепатиты – не подходят!)

4. Метод определения по плотности (удельному весу)

5. Спектрофотометрический метод не подходит из-за избытка примесей в исслед. образце

6. Колориметрический метод – качественное определение, основанное на способности белков к образованию цветных комплексов.

7. Турбидиметрический метод – измерение помутнения после осаждения трихлоруксусной кислотой (денатурация+осаждение). Не очень точный. Использ. для количеств. определения белка в моче.

8. Методы, основанные на специфичности сорбции некоторых красителей на поверхности белковой молекулы.

9. Поляриметрический (сухая химия «на полосках»)