2. Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение). Методы культивирования и выделение чистой культуры анаэробов.

Существует три вида получения энергии (и все три известны у бактерий): брожение, дыхание и фотосинтез. Бродильный метаболизм характеризуется образованием АТФ посредством фосфорилирования субстратов. Включает утилизацию органических соединений в качестве доноров и акцепторов электронов (т.е. часть молекул окисляется, часть восстанавливается, при этом освобожденная в процессе окисления субстрата энергия запасается в виде АТФ). Любое брожение проходит две стадии: первая (окисление) включает превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, вторая (восстановление) – использование атомов водорода для восстановления пировиноградной кислоты. Сам процесс образования пировиноградной кислоты включает серию реакций, общих для брожения и аэробного дыхания; у микроорганизмов выделяют три пути образования пировиноградной кислоты из углеводов: гликолитический, Энтнера-Дудорова и пентозофосфатный шунт. Окислительный метаболизм (клеточное дыхание). Дыхание – окислительно-восстановительный процесс, реализующийся с образованием АТФ путем окислительного фосфорилирования. При этом роль доноров Н+ играют органические или неорганические субстраты, а акцепторами служат неорганические соединения. Исключением является анаэробное фумаратное дыхание с образованием сукцината. Если акцептором служит О2, то такой процесс обозначается как аэробное дыхание; если конечным акцептором служат неорганические соединения (нитраты, сульфаты или карбонаты), то его обозначают термином анаэробное дыхание. Независимо от места реализации процесса он представляет собой модификацию химических реакций прямого или непрямого (например, дегидрирование) окисления. При движении электронов по дыхательной цепи создается градиент протонов, энергия которого запасается в виде АТФ. При аэробном дыхании (наиболее общем типе окислительного метаболизма патогенных для человека микроргранизмов и комменсалов) пируват, образованный в реакциях пути Эмбдена-Мейерхофа, превращается в СО2 через ацетилкоэнзим А (ацетил-КоА) и цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, цикл Кребса). Автотрофный метаболизм основан на использовании разнообразных неорганических соединений для получения энергии и синтеза восстановительных эквивалентом.  Фотосинтез. Бактерии способны также утилизировать энергию света для получения триозофосфатов из СО2, преобразуемых в последующем в другие составляющие клетки; подобные реакции объединяют в процесс, обозначаемый термином «фотосинтез». Анаэробное дыхание происходит с использованием неорганических субстратов (например, нитрата, нитрита, сульфата, серы, карбоната, Fe3+) вместо О2 в качестве конечного акцептора электронов. 

Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заклю­чается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пас­теровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиоло­гическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Со­держимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают ана­эробы.

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипя­тят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного мас­ла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы

1.  Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пиро­галлол.

2.  Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну полови­ну засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растоп­ленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, ко­гда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов: 1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга); 2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).