Исследуемые биомедицинские параметры и их диапазон
Для проведения метода используют специальные приборы – хроматографы, которые имеют 3 основных узла: хроматографическая колонка, детектор и устройство для ввода пробы. После ввода пробы в хроматограф под действием потока подвижной фазы компоненты смеси начинают перемещаться вдоль колонки, заполненной сорбентом, с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициенту распределения компонентов. То есть хорошо сорбируемые компоненты передвигаются вдоль слоя сорбента медленнее, чем плохо сорбируемые, поэтому первым из колонки выходит компонент с наименьшим коэффициентом распределения, затем с более высоким и т.д. Сигнал детектора автоматически записывается и регистрируется (обычно на диаграммной ленте самописцем) в виде графика, отражающего расположение хроматографических зон на слое сорбента или в потоке подвижной фазы во времени ( рис 2).
Рисунок 2- расположение хроматографических зон.
Идентификацию пиков неизвестных компонентов анализируемой смеси проводят путем сравнения относительных величин, определяемых непосредственно из хроматограммы, с соответствующими табличными данными для известных соединений. При идентификации в X. достоверен только отрицательный ответ. Например, пик i не является веществом А, если времена удерживания пика i и вещества А не совпадают. Совпадение времен удерживания пика i и вещества А – необходимое, но недостаточное условие для заключения, что пик i - это вещество А. Для идентификации веществ Х. может использоваться в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для количественного анализа определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам.
СОРБЕНТ - твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве неподвижной фазы.
АДСОРБЕНТ - твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. Адсорбентом заполнена хроматографическая колонка, в которой, в свою очередь, происходит разделение смеси веществ на отдельные компоненты.
СОРБАТ - компонент анализируемой смеси, внесенной в хроматографическую колонку.
ЭЛЮЕНТ - растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализируемой смеси через хроматографическую колонку (подвижная фаза).
ЭЛЮАТ - раствор, выходящий из хроматографической колонки.
Описание метода
Разделение смеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основываются на различии коэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями. Коэффициент распределения вещества равен:
Кп,н=сп/сн
где сп и сн — концентрация вещества в подвижной и неподвижной фазах.
Для членов одного гомологического ряда установлены некоторые закономерности в величинах Кп.н. Известна, например, зависимость Кп.н в данном гомологическом ряду от числа атомов углерода.
Поиск несмешивающихся фаз, обеспечивающих разделение, обычно производится эмпирически на основе экспериментальных данных. Широкое применение в жидкостно-жидкостной хроматографии получили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихся растворителей и третьего, растворимого в обеих фазах. Такие системы позволяют получать набор несмешивающихся фаз различной селективности. В качестве примера можно привести систему из несмешивающихся между собой гептана и воды, в которую введен этанол, растворяющийся в обоих растворителях.
Хотя в качестве подвижной и неподвижной фаз выбираются растворители, не смешивающиеся между собой, все же во многих системах наблюдается некоторая взаимная растворимость. Чтобы предотвратить процессы взаимного растворения жидкостей в ходе хроматографирования, подвижную жидкую фазу предварительно насыщают неподвижной. Для сохранения неизменного состава фаз применяют также метод химического закрепления неподвижной фазы на сорбенте. При этом используют взаимодействие растворителя с группами ОН- на поверхности носителя. Адсорбенты с закрепленной на их поверхности жидкой фазой выпускаются промышленностью.
Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии и другими физическими свойствами жидкостей. С уменьшением вязкости подвижной фазы сокращается продолжительность анализа, но с увеличением вязкости несколько возрастает эффективность. В практике обычно используют маловязкие растворители, так как возрастание эффективности колонок при увеличении вязкости не очень велико.
Носитель неподвижной фазы должен обладать достаточно развитой поверхностью, быть химически инертным, прочно удерживать на своей поверхности жидкую фазу и не растворяться в применяемых растворителях. В качестве носителей используют вещества различной химической природы: гидрофильные носители - силикагель, целлюлоза и др. и гидрофобные — фторопласт, тефлон и другие полимеры.
Рисунок 3. Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селективности хроматографической системы:
а - нормальная селективность, пониженная эффективность;
б - нормальная эффективность и селективность;
в - повышенная селективность, нормальная эффективность.
Распределительная хроматография на бумаге (бумажная хроматография)
Кроме обычных носителей, используемых для заполнения колонок, в распределительной хроматографии применяют специфический носитель, позволяющий обходиться вообще без колонки. Таким носителем является специальная хроматографическая бумага, а методика, основанная на ее применении, получила название распределительной хроматографии на бумаге или распределительной бумажной хроматографии. Во многом она сходна с хроматографией в тонком слое (ТСХ). Бумажную хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на:
Распределительную
Адсорбционную
Ионообменную
Препаративную
Аналитическую.
В распределительной бумажной хроматографии можно выделить:
нормальную
обращённо-фазную хроматографию.
По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: