Экспериментальная часть

1. Подготовить посевной материал.

2. Приготовить питательные среды с различными источниками углерода.

3. Осуществить процесс культивирования дрожжей. Предварительно построить калибровочный график зависимости оптической плотности D от концентрации биомассы дрожжей X (г/л).

4. Выполнить аналитические исследования: определить содержание биомассы в культуральной жидкости, количества белка в биомассе, содержание остаточного субстрата. С целью выявления запасного вещества – гликогена приготовить препарат дрожжевой суспензии «раздавленная капля» и микроскопировать его с объективом 40×.

Подготовка посевного материала

Дрожжи стерильно пересевают с музейного косяка на свежий косяк сусло-агара. Затем пересеянные косяки помещают в термостат при температуре 36 ^оС и выдерживают их там в течение 24 часов. Выращенную культуру дрожжей смывают с косяка в стерильных условиях стерильным физиологическим раствором из расчета 5 мл физраствора на 1 косяк. Полученную суспензию дрожжей объемом 2 мл стерильно переносят в колбы со стерильной питательной средой в объеме 100 мл.

Приготовление питательных сред

Для культивирования дрожжей р. Candida или р. Saccharomyces в данной работе используются синтетические питательные среды, различающиеся источником углерода. Для приготовления трех питательных сред готовятся растворы:

- глюкозы (раствор 20 г/л). Раствор глюкозы стерилизуют в автоклаве 0,5 часа под давлением 0,5 атм;

- этанола (1 % об.);

- глюкозо-спиртовой смеси (готовится из индивидуальных растворов в соотношении 1:1).

Кроме источника углерода для приготовления питательных сред используются следующие источники минерального питания:

1) для культивирования дрожжей р. Candida:

NH₄H₂PO₄ – 10 г/л, MgSO₄ – 0,7 г/л, Na₂HPO₄×12Н₂О – 0,7 г/л,

КН₂РО₄ – 6,8 г/л;

2) для культивирования дрожжей р. Saccharomyces:

(NH₄)₂SO₄ – 5-10 г, СаCl₂×4 H₂O – 1 г, MgSO₄×7 H₂O – 7-10 г,

NaCl – 5-10 г, KH₂PO₄ – 30-40 г, K₂HPO₄ – 1 г.

Приготовленную минеральную среду объемом 250 мл стерилизуют в автоклаве 1 час под давлением 1 атм 10-20 мин.

Раствор микроэлементов готовят и стерилизуют отдельно. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,25 г FeSO₄, 1,25 г MnSO₄, 1,25 г ZnSO₄, 0,63 г NaCl и добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Приготовленный раствор стерилизуют при 1 атм 10-20 мин и стерильно вносят в колбу с ранее приготовленной минеральной средой из расчета 1 мл на 1 л минеральной среды.

Далее раствор стерильно разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 100 мл и закрывают ватно-марлевыми пробками.

В колбы с раствором стерильно добавляют 1 % об. дрожжевого автолизата в качестве фактора роста (источника витаминов, аминокислот, ферментов и т.п.), а также приготовленные ранее растворы, содержащие источники углерода (внимание: этанол вносится в колбы вдали от пламени !).

Затем в качалочные колбы с питательной средой вносят инокулят из расчета 1 мл приготовленной суспензии дрожжевых клеток на 20 мл питательной среды.

Построение калибровочного графика

Построить калибровочный график зависимости оптической плотности дрожжевой суспензии D от концентрации биомассы суспензии Х.

Для этого следует приготовить модельные суспензии с концентрациями биомассы, указанными в первой строке таблицы, провести измерения их оптической плотности и заполнить вторую строку таблицы. По результатам измерений построить калибровочный график D=f(X).

Х, г АСБ/л	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,8
D	0

Для измерения оптической плотности использовать фотоэлектроколориметр с установкой длины волны проходящего света λ=490 нм для кюветы с толщиной рабочего слоя образца 5 мм.