Клеточные структуры

Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем – слизистой капсулой или чехлом. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Поэтому чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) при помощи жидкой туши.

Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Споры можно обнаружить путём дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. Споры, имеющие многослойную и труднопроницаемую оболочку, окрашиваются только при нагревании или после протравливания раствором кислот.

Клеточная стенка. С молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки связывают способность бактерий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином они приобретают красную окраску.

Кислотоустойчивость – свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Это способность клеток сохранять окраску при последующей обработки их раствором минеральных кислот. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточных стенок, высоким содержанием сложных липидов, в частности, наличием миколовых кислот. Кислоты соединяются сложноэфирной связью с углеводом клеточной стенки, придавая оболочке гидрофобный характер. Для выявления кислотоустойчивости бактерий применяют окраску по методу Циля-Нильсена.

Жгутики обуславливают способность микроорганизмов к движению. Способность микроорганизмов к движению выявляют в препаратах «висячая капля» или «раздавленная капля». Подвижность клеток следует отличать от их пассивного перемещения в результате броуновского движения, которое особенно заметно в суспензиях с большой плотностью (для различения к капле исследуемой культуры добавляют каплю 0,5%-го водного раствора фенола, активное движение тотчас прекращается, а броуновское продолжается). Подвижность определяют у клеток молодой, чаще всего суточной культуры, поскольку с возрастом клетки могут ее терять. Расположение и количество жгутиков в ряде случаев имеет диагностическое значение. Отдельный жгутик настолько тонок, что не неразличим в световой микроскоп без окрашивания, увеличивающего его толщину. Все способы окрашивания жгутиков (Леффлера в модификации Пешкова, Фонтана) основаны на использовании протрав, осаждающихся на их поверхности и увеличивающих их диаметр.

Содержание лабораторной работы

Задание 1. Обнаружение гранул волютина по методу Омелянского.

Объект исследования – чистая культура пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) или клостридий (Clostridium pasteurianum). На предметном стекле готовят тонкий мазок из капли водной взвеси микроорганизмов. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают карболовым фуксином 30–40 секунд и промывают водой. Затем мазок дифференцируют, промывая его 1 % раствором серной кислоты и немедленно промывая водой. Серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зёрна волютина остаются окрашенными. Препарат докрашивают метиленовым синим 20–30 секунд, промывают водой и микроскопируют в иммерсионной системе. На препарате зёрна волютина будут окрашены в красный цвет, цитоплазма клетки – в голубой.

Задание 2. Окрашивание спор по методу Пешкова.

Объект исследования – чистая культура бактерий рода Bacillus или Clostridium. На обезжиренном предметном стекле готовят мазок культуры микроорганизма, фиксируют в пламени спиртовки и окрашивают метиленовым синим при нагревании над пламенем. Продолжительность окраски, считая с момента закипания красителя, 10–20 секунд (по мере испарения красителя добавляют новые его порции). Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают водой, после чего докрашивают 0,5 %-ным водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Препарат промывают и микроскопируют в иммерсионной системе. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры – синий цвет.

Задание 3. Негативная окраска слизистых капсул по Омелянскому.

Объект исследования – чистая культура сенной палочки (Bacillus subtilis). Каплю водной взвеси микроорганизмов на предметном стекле смешивают с каплей карболового фуксина, выдерживают 2–3 минуты. Затем прибавляют каплю чёрной туши, снова хорошо размешивают, размазывают тонким слоем по стеклу и высушивают на воздухе. Препарат микроскопируют в иммерсионной системе. В поле зрения микроскопа на чёрном фоне отчётливо видны окрашенные в розовый цвет клетки бактерий, вокруг которых видны светлые неокрашенные капсулы в виде различной величины ободков.

Задание 4. Окраска по методу Грама.

Объект исследования – любая из выделенных на предыдущем занятии чистых культур микроорганизмов. На одном предметном стекле поочерёдно готовят и фиксируют три мазка: в центре – мазок исследуемого микроорганизма, а справа и слева – контрольных: грамотрицательного и грамположительного. Фиксированные мазки последовательно окрашивают генциановым фиолетовым (1–2 минуты) и раствором Люголя (1 минута). Затем мазок промывают 96 % этанолом и водой. После промывания дополнительно окрашивают мазок раствором карболового фуксина (30 секунд), промывают водой и микроскопируют в иммерсионной системе. Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый.

Задание 5. Выявление кислотоустойчивости по Цилю-Нильсену.

На предметном стекле готовят два фиксированных мазка: исследуемой культуры и клеток кислотоустойчивых микобактерий. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и 2–3 раза подогревают до появления паров, держа стекло высоко над пламенем. Препарат остужают, промывают водой и обесцвечивают погружением в стаканчик с 0,5 % раствором серной кислоты (погружают, не задерживая, 2–3 раза). Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение 3–5 минут. Затем препарат вновь промывают водой, высушивают и исследуют в иммерсионной системе. При строгом соблюдении режима окрашивания кислотоустойчивые бактерии приобретают красный цвет, а не кислотоустойчивые – синий.

Задание 6. Окрашивание по Романовскому-Гимзе.

На предметном стекле готовят мазок культуры бактерий (спирохет) или крови, фиксируют в жидком фиксаторе (метаноле, этаноле, смеси этанола с эфиром 1:1). На мазок наносят рабочий раствор красителя Романовского-Гимзе (1 капля красителя на 10 капель дистиллированной воды) на 10-20 минут. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Эритроциты крови окрашиваются в розово-коричневый, лейкоциты в сиреневый (их ядра – в фиолетовый), бактериальные клетки – в красно-фиолетовый.