Задание 2. Приготовление фиксированного мазка микроорганизмов и изучение при помощи иммерсионной системы микроскопа

Объект исследования – накопительная культура Bacillus subtilis, навозный настой или чистые культуры бактерий на плотной питательной среде и в бульоне. Приготовить фиксированный мазок, окрасить метиленовым синим, изучить при увеличении ×100 и зарисовать.

а) Приготовление фиксированного мазка. Предметное стекло прокаливают в пламени спиртовки для лучшего обезжиривания. По центру остывшего стекла микробиологической петлёй, простерилизованной в пламени спиртовки, наносят мазок исследуемого материала. Если культура микроорганизма выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю водопроводной воды, в неё микробиологической петлёй вносят небольшое количество материала и делают мазок. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. Обычно мазки фиксируют термическим способом, проводя предметное стекло 3–5 раз через пламя спиртовки мазком вверх. После фиксации мазок окрашивают, для чего растворы красителей наносят непосредственно на мазок; либо накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную красителем и смачивают водой. По истечении времени окрашивания мазок промывают проточной водой, осторожно обсушивают фильтровальной бумагой и изучают с иммерсионным объективом.

б) Правила микроскопирования с иммерсионным объективом. Рассматривают готовый фиксированный препарат при сухом объективе с увеличением X10 и находят лучшее место для детального исследования. Затем в поле зрения микроскопа наносят каплю иммерсионного масла непосредственно на мазок. Далее ставят иммерсионный объектив и, глядя сбоку, погружают в иммерсионное масло его нижнюю фронтальную линзу. Затем, глядя в окуляр, медленно поднимают тубус микроскопа до появления в поле зрения изучаемого объекта. Можно уточнить фокус микрометрическим винтом. После окончания работы необходимо удалить иммерсионное масло с объектива микроскопа при помощи ватного тампона, смоченной спирто-эфирной смесью.

Задание 3. Изучение различных морфологических групп микроорганизмов

Изучить с иммерсионным объективом и зарисовать фиксированный мазок навозного настоя, окрашенный по Романовскому-Гимзе или готовые фиксированные препараты стафилококков, тетракокков, монококков, сарцин, клостридий, бацилл.

Контрольные вопросы

1. Дайте понятие культуры микроорганизмов, перечислите виды лабораторных культур микроорганизмов.

2. Перечислите методы микроскопического исследования микроорганизмов, приведите положительные и отрицательные стороны каждого метода.

3. Какие препараты можно приготовить для наблюдения живых клеток?

4. Какие красители можно использовать при приготовлении прижизненных препаратов микроорганизмов?

5. С какой целью применяется фиксация при приготовлении препаратов микроорганизмов?

6. Для чего при изучении фиксированных препаратов микроорганизмов используют иммерсионное масло?

7. На какие группы делят бактерии по форме клеток?

8. Какие группировки могут образовывать шаровидные бактерии?

9. Перечислите типы извитых бактерий, приведите их отличия.

1.2. Тинкториальные свойства микроорганизмов. Методы окраски. Ультраструктура бактерий

Цель занятия

Познакомиться с простыми и дифференцированными методами окрашивания препаратов микроорганизмов, освоить методику выявления клеточных структур микроорганизмов.

Основные сведения

Морфологические особенности клеток микроорганизмов можно изучать, используя различные методы микроскопии, а также применяя некоторые способы дифференциальной окраски. Тинкториальными свойствами называют способность клеток микроорганизмов воспринимать различные красители.

Красители, методы окраски препаратов микроорганизмов

Клетки микроорганизмов окрашивают, главным образом, анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители в зависимости от того, где в молекуле красителя стоит хромофорная (красящая группа). Если она находится при анионе – краска является кислой (например, индиго-кармин, эозин, эритрозин), если при катионе – основной (нейтральный красный, метиленовый синий, генциановый фиолетовый). Бактериальные клетки лучше всего окрашиваются основными красителями, так как они интенсивнее связываются с ядерными компонентами клеток (высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерий делает её более чувствительной к основным красителям)..

Различают простые и дифференциальные (сложные) способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание определенных структур клетки (или запасных питательных веществ) а также дифференциацию микроорганизмов по особенности строения клеточной стенки (окрашивание по методам Грама и Циля-Нильсена) или ядерного материала (окрашивание по методу Романовского-Гимзе).

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов фиксированные мазки помещают над стеклянной кюветой и заливают раствором красителя на 1–3 минуты. При подсыхании мазка подливают новые порции красителей. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии фиксированные или нативные препараты микроорганизмов окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином.