Методы микроскопического исследования микроорганизмов

Несмотря на то, что за последнее время достигнуты большие успехи в области изучения морфологии микроорганизмов методом электронной микроскопии, световой микроскоп также не утратил своего значения. Существует два основных метода микроскопического исследования микроорганизмов при помощи светового микроскопа:

- метод прижизненного исследования;

- метод фиксированных мазков.

Определенное представление о форме, размерах и движении микробной клетки можно получить, изучая её прижизненно. Для прижизненного микроскопирования бактерий готовят препараты раздавленная и висячая капля и исследуют при увеличении ×40. Однако, клетки большинства микроорганизмов бесцветны и прозрачны, что затрудняет их изучение. Поэтому часто препараты для прижизненного исследования микроорганизмов слегка подкрашивают нейтральной краской. Для этой цели используют красители, не нарушающие жизнедеятельность микробов: нейтральный красный, растворы метиленового синего и кислого фуксина слабой концентрации.

Для более детального изучения клеток микроорганизмов используют фиксированные препараты. Приготовление фиксированных препаратов складывается из следующих операций: приготовление мазка, высушивание препарата, его фиксация (при которой микроорганизмы погибают) и окраска. Фиксированные мазки изучают при увеличении ×90 (×100), используя иммерсионный или маслянопогружённый объектив, дающий увеличение в 900–1350 раз. При работе с иммерсионным объективом его погружают в каплю кедрового или вазелинового масла, нанесённого на препарат. Показатель преломления иммерсионного масла близок к показателю преломления стекла и между стеклом и линзой объектива устанавливается однородная среда. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не меняя своего направления, попадают в объектив и обеспечивают хорошую видимость мельчайших объектов.

Для приготовления мазка из гноя или мокроты используют стерильные препаровальные иглы, с помощью которых кусочек субстрата помещают на середину предметного стекла, вторым стеклом покрывают сверху. Прижав одно стекло к другому, растирают материал, пока не получат тонкий мазок.

Препарат крови больного готовят по следующей методике: предметным стеклом, отступая 1–2 см от края, прикоснуться к капле крови, выступившей после укола. Быстро, чтобы кровь не свернулась, ребром шлифованного стекла распределить ее по всей поверхности стекла.

Наиболее распространенным способом фиксации мазков является фиксация в пламени. Предметное стекло (мазком вверх) троекратно проводят через пламя. При таком способе фиксации сохраняются форма бактерий, споры, зерна волютина, однако этот способ фиксации нельзя применять для мазков крови, мазков-отпечатков из органов, а также при выявлении спор и жгутиков. Для этих целей проводят фиксацию в этиловом спирте (20 минут), в жидкости Никифорова (смесь эфира и этанола 1:1, 20 минут) или в холодном ацетоне.

Методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (иммерсионный, темнопольный, фазово-контрастный).

1. Чаще всего используют метод микроскопии в проходящем свете (светлопольную микроскопию). Этот метод используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах.

2. Темнопольная микроскопия применяется для прижизненного изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости. Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. При таком способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светящиеся частицы.

3. Фазово-контрастная микроскопия предназначена для изучения нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Свет проходит через различные биологические объекты с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, включающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобразование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом, достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негативной. Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный биологический микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.

4. Люминесцентная микроскопия основана на явлении фотолюминесценции – люминесценции объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета, в результате чего возникает цветное изображение объекта. Первичная люминесценция биологических объектов (собственная или биолюминесценция) наблюдается без предварительного окрашивания за счет наличия собственных люминесцирующих веществ. Вторичная (наведенная) – возникает в результате окрашивания препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновый оранжевый, ауромин, корифосфин и др.). Преимущества метода – возможность исследовать живые микроорганизмы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

5. Электронная микроскопия позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2мкм). Электронный микроскоп применяют для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. Световые лучи в таких микроскопах заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005нм. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа, достигающая 0,1-0,2нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1 000 000. Наряду с микроскопами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта.