Микротест–системы для определения чувствительности к антимикробным препаратам

Микротест–системы предназначены для быстрого определения клинической чувствительности к антибиотикам бактерий определенных видов или родственных групп. Тестируемые препараты в стандартных концентрациях находятся в лунках готовых пластиковых планшетов. Определяют чувствительность исследуемой культуры к двум концентрациям каждого антибиотика: средней терапевтической и максимальной. Материал из изолированной колонии с помощью мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, и готовят суспензию. Готовую бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора, что позволяет существенно сократить сроки исследования. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.

Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам с помощью е–теста

Е-тест представляет собой вариант диффузного метода, позволяющий определять МПК антибиотика. Вместо дисков используют стандартные полимерные полоски, приготовленные по специальной технологии (AB BIODISK) и содержащие иммобилизованные антимикробные препараты, нанесенные в виде непрерывного градиента концентрации. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении полоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствующего шкале. Процедура определения чувствительности с помощью Е-теста осуществляется аналогично тестированию методом дисков. После инкубации посева вокруг полоски образуется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е – теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные критерии (прил. 2).

Содержание лабораторной работы

Задание 1. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом дисков.

Объект исследования – выделенная чистая культура микроорганизма. Выполнить посев чистой культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды в чашке Петри, для чего равномерно нанести (используя стерильный шпатель) на поверхность среды 0,7–1 мл суточной бульонной культуры микроорганизмов (избыток жидкости можно удалить с помощью стерильной пипетки). Затем на поверхность засеянной среды с помощью стерильного пинцета нанести 5 стандартных дисков, пропитанных разными антибиотиками. Засеянные чашки с диском помещают в термостат на 18–24 часа при 37ºС вверх дном. Измерение бактерицидной зоны проводят с помощью линейки и циркуля, включая диаметр самого диска. При зоне диаметром до 10 мм штамм расценивают как устойчивый, 11–15 мм – малоустойчивый, 15–25 мм – чувствительный, 25 мм и более – высокочувствительный.

Задание 2. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения.

Объект исследования – выделенная чистая культура микроорганизма. Из порошка исследуемого антимикробного препарата готовят основной раствор в стерильной дистиллированной воде (некоторые препараты растворяют в соответствующем стерильном растворителе) и ряд двукратных разведений (табл. 2) в стерильной жидкой питательной среде в стерильных пробирках.

Таблица 2

Определение МПК антимикробных препаратов методом серийных разведений

Номер пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика, мкг/мл	Рост бактерий (помутнение среды)
1	1:100	100	_
2	1:200	50	_
3	1:400	25	_
4	1:800	12,5	_
5	1:1600	6,25	+
6	1:3200	3,12	+
7	Среда без антибиотика (контроль)	_	+

Диапазон серии разведений определяют установленными критериями чувствительности микроорганизма. В приготовленные разведения антибиотика вносят по 0,1–0,2 мл суточной бульонной культуры исследуемого микроорганизма в концентрации 10³–10⁵ м/о/мл, перемешивают и термостатируют 18–20 часов при 37ºС. Параллельно ставят контрольные пробы: контроль питательной среды и контроль культуры микроорганизмов. После инкубации определяют МПК – концентрацию препарата в последней пробирке с отчетливо видимой задержкой микробного роста. Для уточнения полученного результата содержимое двух последних пробирок с видимой задержкой роста в объеме 0,5–0,7 мл высевают на плотные среды в чашки Петри, термостатируют при таких же условиях и отмечают наличие или отсутствие роста.