Этапы приготовления питательных сред

1. Согласно прописи в дистиллированную среду вносят необходимые компоненетыи растворяют при нагревании.

2. Определяют рН среды с помощью индикаторных бумажек или электропотенциометров (с учетом того, что после стерилизации рН снизится на 0,2).

3. Жидкие и желатиновые среды фильтруют через фильтровальную бумагу, среды с агаром (в горячем состоянии) – через ватно-марлевый фильтр.

4. При необходимости питательную среду осветляют обработкой белком куриного яйца, сывороткой или осаждением.

5. Среды готовят в чистой нестерильной посуде, если среда подлежит стерилизации при 120ºС; или в стерильной посуде, если среда требует стерилизации при более низкой температуре.

6. Агаровые среды, не содержащие углеводов и нативного белка, и синтетические среды стерилизуют в автоклаве при 115–120ºС в течение 15 минут.

7. Среды, содержащие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром при 100ºС дробно или в автоклаве при 112ºС в течение 15 минут.

8. Среды, содержащие нативные белок или мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компоненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды.

9. Готовые стерильные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдерживания в термостате при 37ºС в течение 1–3 сут.

Промышленным способом некоторые среды изготавливаются в виде сухих порошков. Преимущественно таких сред в их стандартности, удобстве при транспортировке. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Примеры питательных сред и их состав приведены в Приложении 1.

Содержание лабораторной работы

Задание 1. Знакомство с ассортиментом готовых сухих питательных сред

Познакомиться с ассортиментом готовых сухих питательных сред. Оформить в тетради конспекты, в которых указать: название среды, предназначение, состав, принципы использования. Для выполнения конспектов использовать материал Приложения 1.

Задание 2. Приготовление универсальных питательных сред

Для выделения и изучения большинства микрорганизмов чаще всего используют питательный агар и питательный бульон.

а) 2–3 г готового порошка сухого питательного агара разводят в 100 мл водопроводной воды, нагревают до полного разжижения агар-агара (но не до кипения!) и разливают по колбам или пробиркам. Колбы подписывают, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Примечание: питательный агар готовят в объеме из расчета 12–15 мл среды на одну чашку Петри.

б) 2–3 г готового порошка сухого питательного бульона разводят в 100мл водопроводной воды, нагревают до кипения и кипятят 2–3 минуты. При необходимости фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам или пробиркам. Колбы подписывают, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Задание 3: Взятие материала от пациента и получение накопительных культур микроорганизмов.

Взятие материала от пациентов, транспортировка в микробиологическую лабораторию и дальнейшие исследования регламентированы Приказом №535 МЗ РФ от «про» и МУ 4.2.2039-05 (Методическими указаниями) «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» от 1 июля 2006 г.

Получение пробы со слизистой глотки (зева). Мазок из зева (глотки) собирают натощак или через 3–4 ч после приема пищи. Перед взятием пробы больной должен прополоскать рот теплой кипяченой водой. При взятии пробы со слизистой зева (глотки) не касаются тампоном слизистых щек, языка, десен, губ, а также не собирают слюну, так как этот материал характеризует слизистые ротовой полости, то есть верхний отдел желудочно-кишечного тракта. Для получения пробы используют стерильный шпатель или тампон: извлекают вискозный тампон из стерильной одноразовой пробирки (тубсера) или используют приготовленный в лаборатории тампон, вмонтированный в стерильную стеклянную пробирку.

Одной рукой прижимают язык больного стерильным шпателем. Другой рукой собирают материал, поочередно обрабатывая тампоном правую миндалину, правую небную дугу, левую миндалину, левую небную дугу, язычок, на уровне язычка касаются тампоном задней стенки глотки. Помещают тампон в стерильную одноразовую или стеклянную пробирку и доставляют в лабораторию.

Примечание! При наличии очагов воспалений или изъязвлений на слизистой относятся к сбору пробы особенно внимательно и собирают отдельным тампоном дополнительно материал из очага (очагов).

а) посев пробы со слизистой глотки (зева) на питательный агар. Посевной материал втирают тампоном в небольшой сегмент поверхности питательного агара у края чашки Петри. Затем материал с получившейся площадки петлей рассевают параллельными штрихами по поверхности среды. При этом достигается последовательное уменьшение количества микробов вплоть до единичных клеток. При таком способе посева в одной чашке Петри можно получить изолированные колонии микроорганизмов.

б) посев пробы со слизистой глотки (зева) в питательный бульон. Тампон погружают в колбу (пробирку) со стерильным питательным бульоном, материал с тампона растирают на стенке сосуда, а потом смывают жидкой средой, слегка встряхивая колбу (пробирку).

Выполненные посевы термостатируют 24–48 часов при 37ºС.

Задание 4: Получение накопительных культур сапрофитных микроорганизмов.

а) Получение накопительной культуры целлюлозоразрушающих бактерий. В большую стерильную пробирку с ватно-марлевой пробкой поместить 2–3 полоски фильтровальной бумаги и доверху долить питательной средой следующего состава: NH₄H₂PO_{4 (}0,2г), MgSO₄•7H₂O (0,05г), CaCl2 (0,03г), пептон (0,1г), KH₂PO₄ (0,1г), CaCO₃ (0,5г), вода 100 мл. Затем заразить среду бактериями, внося комочек почвы (богатой перегноем) или свежего конского навоза, закрыть пробкой и поместить в термостат при температуре 30ºС на 7 дней. Под влиянием бактерий в анаэробных условиях фильтровальная бумага будет разлагаться.

б) Получение накопительной культуры пектиноразрушающих бактерий. Сделать снопик из сухих стеблей злаков длиной 4–5 см, перевязать его в двух местах ниткой. Для удаления экстрактивных веществ снопик погрузить в термостойкую колбу с водой и кипятить 10 мин. Затем снопик перенести в пробирку с водой, внести кусочек мела, и снова кипятить (над пламенем горелки), чтобы удалить из воды кислород. Закрыть ватной пробкой и поместить в термостат на 7 дней.

в) Получение накопительной культуры клубеньковых бактерий. В колбу налить питательную среду следующего состава: 100 мл бобового отвара, 0,1 г KH₂PO₄, 0,03 г MgSO₄•H₂O, 0,2 г сахарозы. В фарфоровой чашечке растереть корневые клубеньки гороха или фасоли и поместить в колбу с питательной средой, закрыть ватной пробкой, поставить в термостат на 7 дней.

г) Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий. Взять неповрежденные клубни картофеля (неочищенные), нарезать маленькими кусочками и положить в пробирку, добавить немного мела, доверху доливают водой, нагревают до 80ºС, затем закрывают пробкой и помещают в термостат на 7 суток.