Содержание лабораторной работы

Задание 1. Приготовление нативных препаратов микроскопических грибов.

На предметном стекле смешивают каплю воды и каплю красителя нейтрального красного. В полученную каплю осторожно вносят с помощью препаровальной иглы часть спороносящего мицелия изучаемой колонии гриба, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при большом увеличении (×40). Находят и зарисовывают характерные части спороносящего мицелия. Препарат можно окрасить нейтральным красным.

Задание 2. Приготовление фиксированных мазков из культур простейших и окрашивание по Романовскому-Гимзе.

На предметном стекле готовят фиксированный мазок чистой или накопительной культуры простейших, окрашивают по Романовскому-Гимзе или фуксином. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Контрольные вопросы

1. Какие морфологические особенности грибов позволяют их дифференцировать от других микроорганизмов при микроскопировании?

2. На каких биологических особенностях основана классификация грибов?

3. Какие методы микроскопического исследования используют при изучении патогенных микроскопических грибов? Какими красителями окрашивают препараты?

4. Какие морфологические особенности простейших используют для микроскопической диагностики?

5. Какие препараты готовят при микроскопировании простейших и почему?

6. Какие красители используют при приготовлении препаратов простейших?

Раздел 2. культивирование микроорганизмов и выделение чистых культур

2.1. Культивирование микроорганизмов. Питательные среды

Цель занятия

Познакомиться с условиями культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях и с ассортиментом питательных сред, освоить методы приготовления питательных сред, поставить опыт по получению накопительных культур микроорганизмов.

Основные сведения

Культивирование микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах.

Условия культивирования микроорганизмов

Для роста микроорганизмов существенное значение имеет не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0. Микроскопические (плесневые и дрожжевые) грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определять значение рН. В случае необходимости кислотность среды доводят до нужного значения растворами кислот, щелочей или солей, имеющих кислотную реакцию (Na₂CO₃, NaHCO₃). Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Чтобы избежать этого, в среды добавляют буферные растворы (чаще фосфатные) или избыточное количество мела.

Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода (группа облигатных аэробов). Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода (облигатные анаэробы). Существует также переходные группы микроорганизмов по потребности в кислороде.

Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.

Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.

При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO₃.

Температура. Интервал температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируется. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам микроорганизмов, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37ºС. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80–90ºС. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5–10ºС. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причём вода должна находиться в доступной для клетки форме, то есть в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворённых веществ и не может быть использована микроорганизмами. Различную активность воды в питательной среде создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.