IV. Молекулярная биофизика Предмет молекулярной биофизики

Молекулярная биофизика изучает структуру и физические закономерности организации биомакромолекул, силы и связи, обеспечивающие их функции в биологических системах. К биомакромолекулам относят белки и нуклеиновые кислоты. Их молекулярная масса и размеры весьма вариабильны 1-1000 кD. Состоят биомакромолекулы из множества (десятки и сотни тысяч) соединенных ковалентными связями атомных групп. Такая сложность строения требует особых методов исследования.

Методы исследования биомакромолекул

1. Методы, связанные с оценкой подвижности макромолекул в растворе, что позволяет судить об их форме и молекулярной массе. Например, оценка поступательной и вращательной диффузии макромолекул. Первая используется для молекул преимущественно сферической формы, вторая – эллипсоидной.

Известно, что при движении молекул в растворе возникает сила трения:

F = f , где

f – коэффициент внутреннего трения (фракционный коэффициент),  -скорость.

Для сферической макромолекулы эта сила будет равна (формула Стокса):

F=6   r, где

 – вязкость среды, r – радиус молекулы

Для определения величины f можно использовать коэффициент диффузии:

и тогда:

а так как масса молекулы равна:

,

то есть масса молекулы обратно пропорциональна коэффициенту диффузии в третьей степени.

Для макромолекул вытянутой формы используется коэффициент вращательной диффузии ; для оценки которого используют метод двойного лучепреломления в потоке.

Способ определения коэффициента диффузии лежит в основе методов:

Квазиупругое рассеяние света. Этот метод основан на свойстве рассеянного света изменять .

Изменение  при движении молекул приводит к возникновению эффекта Доплера. Получается информация о динамических свойствах молекул (поступательная и вращательная диффузия, внутримолекулярное время релаксации).

При спонтанной диффузии молекул, обусловленной тепловым движением молекул, спектр рассеянного света подчиняется распределению Лоренца:

где:

I – интенсивность рассеянного света, w – круговая частота (2  ) света,

N – число макромолекул в исследуемом объёме,

– фактор рассеяние,

D – коэффициент поступательной диффузии,  – угол рассеяния света,

 – молекулярная поляризуемость.

Полуширина спектра:

.

Измеряя полуширину как функцию sin²/2, можно получить коэффициент диффузии D.

Сидементация молекул-осаждение веществ в жидкости под действием силы тяжести.

Допустим, в пробирке имеются молекулы с молекулярной массой 10⁵, высота столба жидкости 10^-2 м, тогда:

Следовательно, тепловая энергия в 200 раз больше энергии седиментации.

Для регистрации седиментации нужно увеличить уровень энергии на 4 – 5 порядков, что делают с помощью центрифуги. Обычно используют 350 000 g(60 – 70 тыс.об./мин).

– скорость седиментации.

Определяя положение шлирен – пик в различные моменты времени, вычисляют скорость седиментации.

На молекулу действуют силы относительно оси вращения ротора:

F_c – сила сопротивления,

F_в – сила выталкивания,

F_ц – центробежная сила.

Седиментация заканчивается, когда

где m – масса, w-объем, r – радиус молекулы, а F с^-1, n – об/мин.

,

где m₀ (₀) – масса (плотность) вытолкнутой жидкости

f – коэффициент внутреннего трения,  – скорость седиментации.

F_ц – F_в = F_с и выразим F_в через F_ц.- F_с:

или:

Введем:

где S – коэффициент седиментации (1 сведберг= 10^-3с).

Парциальный удельный объём:

для макромолекул это возрастание объёма растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объёме растворителя.

– формула Сведберга.

Следовательно, нужно заранее определить D и V и измерить на центрифуге S и получим ММ. Необходимо определить S и D в одинаковых растворителях, при одной температуре.

Электрофорез макромолекул – движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля.

F_э=q E,

где q – заряд молекулы, Е – напряжённость поля, F_э – действующая сила.

F_c=f ,

где f – коэффициент трения (для сферы 6r), F_c – сила сопротивления,

 – скорость движения.

После установления стационарного состояния:

q E = f  при этом скорость движения постоянна ( = const.)

– электрофоретическая подвижность.

Для сферы:

Если исследуют белки (молекулярную массу), то электрофорез проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в полиакриламидном геле (Вебер, Осборн, 1969). Исследования проводят после обработки 1% раствором ДСН, который является детергентом, обладающим денатурирующим действием, и добавления  – меркаптоэтанола для разрыва дисульфидных связей. ДСН одинаково связывается со всеми белками (1,4 кг ДСН на 1 кг белка). Каждая молекула ДСН несёт один отрицательный заряд и ~ общая плотность зарядов для разных белков.

Таким образом, поверхностная «шуба» из молекул ДСН устраняет зарядовые значения между белками. После денатурации белок приобретает форму стержня 1,8 нм. Длина ~ молекулярной массе.

В качестве носителя используется полиакриламидный гель в концентрации 5 – 15%.

,

где а и в – константы, зависящие от свойств геля.