ТРАНСЛЯЦИЯ

Трансляция: Общие сведения

Трансляция - процесс синтеза белка в цитоплазме клетки. Молекулярные процессы, лежащие в основе синтеза белка, крайне сложны ( Kornberg R.D. et al, 1981 ; McGhee J.D. et al, 1980 ).

В синтезе белка участвует три таких класса молекул РНК ( мРНК , тРНК и рРНК ). Началом синтеза белка принято считать процесс транскрипции ДНК , в результате которого в ядре должна образоваться соответствующая информационная, или матричная, РНК (мРНК), которая затем должна перейти в цитоплазму клетки.

Процесс трансляции начинается с присоединения малой рибосомной субчастицы к молекуле мРНК. Особая инициаторная тРНК связывает малую рибосомную субчастицу со специальным старт- кодоном на мРНК . Присоединение большой субчастицы завершает сборку рибосомы .

Далее следует фаза элонгации . Каждая очередная аминокислота (находящаяся в комплексе с tРНК) присоединяется к карбоксильному концу растущего полипептида с помощью циклического процесса, состоящего из трех последовательных этапов: связывания аминоацил-тРНК, образования пептидной связи и транслокации рибосомы. Рибосома перемещается вдоль молекулы мРНК в направлении 5'-> 3' от одного кодона к другому до тех пор, пока не будет достигнут какой-либо из трех стоп-кодонов . К этому стоп-кодону присоединяется затем фактор освобождения , останавливающий трансляцию и вызывающий отделение завершенного полипептида от рибосомы. Энергия для биосинтеза белка обеспечивается гидролизом GTP .

Большинство данных о механизмах биосинтеза белка у эукариот было получено с использованием бесклеточных белоксинтезирующих систем . Важные результаты о механизмах трансляции у эукариот были получены с использованием стабильно трансформированных клеток животных и растений, выращиваемых в культуре. Установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции.

Клетки животных, кроме основной системы трансляции, локализованной в цитоплазме, имеют дополнительную систему трансляции митохондрий, которая по ряду свойств приближается к бактериальной. Клетки растений обладают дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах.

РИБОСОМЫ

Рибосомы: строение

Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой около 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции.

Рибосомы прокариотических и эукариотических организмов различаются по размерам. У эукариот они представлены 80S частицами, тогда как коэффициент седиментации рибосом прокариот составляет 70S .

Рибосомы всех известных организмов построены из двух неравных субчастиц: прокариотические - 30S и 50S , а эукариотические - 40S и 60S . 70S рибосомы эубактерий в своем составе содержат 55-60 рибосомных белков, для 80S рибосом эукариот это число составляет 75-85. В обоих случаях рибосомные белки в составе рибосом ассоциированы с молекулами рРНК, образуя пространственно организованные рибонуклеопротеиновые тяжи.

На рис. I.18 (http://humbio.ru/humbio/genexp/001ab46f.htm) представлена модель пространственной структуры 70S рибосомы E.coli, разработанная в лаборатории Д. Франка (США).

Рибосомные белки E.coli

Более 50 рибосомных белков выделено в высокоочищенном состоянии. Молекулярная масса самого маленького белка составляет 5 кДа, самого большого - 61 кДа, большинства рибосомных белков - 10-20 кДа. Определены аминокислотные последовательности полипептидных цепей всех рибосомных белков E.coli. Малая рибосомная субчастица содержит 21 белок с суммарной молекулярной массой 350 кДа.

Белки в составе 30S субчастицы ассоциированы с 16S РНК, длина которой составляет 1542 нуклеотида (нт). Суммарные молекулярные массы малой и большой субчастиц рибосом достигают соответственно 850 и 1450 кДа. Третья часть массы большой субчастицы приходится на 34 рибосомных белка, а две третьих - на 23S (2904 нт) и 5S рРНК (120 нт).

Обнаружены специфические внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия между различными функциональными участками рРНК. На прямое участие 23S рРНК в трансляции указывает наличие специфических комплементарных взаимодействий между ней и CCA- концами тРНК, акцептирующими аминокислотные остатки.

Рибосома: бороздки

Информационная РНК шаг за шагом продвигается сквозь рибосому в процессе трансляции . В рибосоме имеется бороздка, удерживающая растущую полипептидную цепь, и бороздка, удерживающая молекулу мРНК . Длина бороздок такова, что в первой из них умещается примерно 30 аминокислот, а во второй - около 35 нуклеотидов РНК. В синтезе белка непосредственно участвуют только два из одиннадцати кодонов , находящихся одновременно в рибосоме ( Sandeen G. et al, 1980 ).

Рибосома: участки связывания с тРНК

В рибосоме имеется два разных участка, связывающих молекулы тРНК . Один из них удерживает молекулу тРНК, присоединенную у растущему концу полипептидной цепи; поэтому его называют пептидил-тРНК-связывающим участком или P-участком ( донорным участком ). Второй служит для удержания только что прибывшей молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком или A-участком ( акцепторным участком ). К обоим участкам молекула тРНК прочно прикрепляется только в том случае, если ее антикодон спаривается с комплементарным ему кодоном мРНК . A- и P-участки располагаются очень близко друг к другу, так что две связанные с ними молекулы тРНК спариваются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК ( Ptashne M. et al, 1970 ; Ohlendorf D.H. et al, 1982 ).

Когда оба участка заняты, происходит образование пептидной связи в результате следующей реакции: полипептидный компонент комплекса пептидил-тРНК переносится на аминокислоту, связанную в аминоацил-тРНК ( реакция транспептидации ). Эта реакция происходит на большой субчастице рибосомы .

Тот конец тРНК, который несет аминокислоту, расположен на большой субчастице, тогда как другой ее конец, т.е. антикодон, взаимодействует с мРНК, связанной малой субчастицей . Следовательно, расположение участков P и A таково, что в их образовании принимают участие обе рибосомные частицы.

Рибосома: Декодирующий сайт: Структура

Для правильного кодон-антикодонового спаривания в декодирующем сайте рибосома должна провести "выравнивание" последовательностей транспортной и матричной РНК и катализировать образование пептида, связанного с другим концом тРНК и пептидил-трансферазным сайтом .

Декодирующий сайт, имеющий в своем составе сайт связывания тРНК ( А-сайт ) и пептидильный сайт ( П-сайт ), включает в себя несколько консервативных районов 16S рРНК , организованных в сложную, высокоупорядоченную структуру. Сшивки между основаниями антикодона N-ацетил-валил-тРНК в П-сайте и нуклеотидом С 1400 на 16S рРНК, индуцированные ультрафиолетовым излучением, указывают на близкое (на расстоянии нескольких ангстрем) размещение кодон-антикодонового сайта и мРНК от нуклеотида С 1400, в ложбинке 30S субъединицы ( Prince et al., 1982 ). Область нуклеотида 1400 (1392-1400) высококонсервативна у всех немитохондриальных рибосомных РНК.

Было показано, что молекула 16S рибосомной РНК содержит три типа сайтов, защищаемых или подвергающихся конформационным изменениям в результате неэнзиматического взаимодействия тРНК с малой субъединицей рибосомы: А-сайт , П-сайт и районы, перекрываемые транспортной РНК и 50S субъединицей рибосомы ( Moazed and Noller, 1986 ). Почти все нуклеотиды, выявленные авторами, высококонсервативны, что согласуется с их предполагаемой функциональной ролью. Хотя защищенные районы расположены в различных областях вторичной структуры 16S рРНК, при ее укладке в трехмерную модель они оказываются в области бороздки 30S субъединицы . Исключением является область 530 нуклеотида, которая предположительно защищается транспортной РНК вследствие аллостерически индуцированных конформационных изменений.

Структурные данные свидетельствуют, что транспортные РНК образуют тесные контакты с большим количеством специфических нуклеотидов мРНК, при этом возможно различение А- и П-сайтов рибосомной РНК. Исследования активной 30S субъединицы, способной к неэнзиматическому связыванию тРНК, выявили изменения реактивности, практически полностью сопряженные с теми же областями мРНК ( Moazed et al., 1986 ). Эти данные свидетельствуют о важности конформационных изменений рРНК для выполнения рибосомой биологических функций.

Функциональные данные из разных источников согласуются с данными о структуре декодирующего сайта, полученными методом фут-принтинга. Первые свидетельства такого рода были получены в экспериментах с химической модификацией рРНК и блокадой ферментативного расщепления 16S рРНК транспортной РНК, стрептомицином или тетрациклином, связанными с А-сайтом ( Nomura and Held, 1974 ). Функциональные сайты на рибосоме выявлялись с помощью антибиотиков, нарушающих кодирование ( Moazed and Noller, 1987 ). Оказалось, что сайты на 16S рРНК, защищаемые антибиотиками, тесно коррелируют с сайтами, защищаемыми тРНК. Так например, эдеин блокирует связывание тРНК с П-сайтом и защищает нуклеотиды G 693, A 794, C 795 и C 926, которые защищаются также и тРНК. Структурно близкие аминогликозиды (неомицин, парономицин, гентамицин и канамицин), нарушающие кодирование, оказывают сходный защитный эффект на нуклеотиды A 1408 и G 1494. Предполагается, что мишенью их действия является А-сайт. Резистентность к этим антибиотикам является результатом модификации рРНК в декодирующем сайте.