Рак и системы репарации: введение

1993 Г. Оказался весьма плодотворным для выявления взаимосвязи между репарацией днк и канцерогенезом .

Независимые исследования двух групп [ Fishel R., Lescoe M.K., et al. 1993 , Leach F.S. Nicolaides N C., et al., 1993 , Parson R., Li G.-M., et al., 1993 , Aaltonen L.A., Peltomaki P., et al., 1993 ], одну из которых возглавили Р.Колоднер и Р.Фишель, а другую - А.Делашапель и Б.Фогельштейн, привели к открытию ряда генов, ответственных за так называемый наследственный неполипозный рак толстой кишки ( ННРТК ) у человека. Как оказалось, эти гены контролируют систему коррекции неспаренных оснований (КНО) ДНК у человека. Вместе с открытием причины возникновения пигментной ксеродермы (повышенной чувствительности кожи человека, к действию УФ-облучения , способной привести к раку кожи ) как последствия повреждения системы эксцизионной репарации нуклеотидов ( ЭРН ) в ДНК, данные о роли КНО окончательно подтвердили предположение о том, что ослабленная репарация ДНК может ускорить развитие ракового заболевания.

Дополнительная информацию имеется в ряде обзоров, анализирующих как системы репарации ДНК на разных уровнях организации генетического материала [ Seeberg E., Eide F., Bjoras M., 1995 , Kolodner R., 1995 , Lehmann A.R., 19959 , Walker G., 1995 , Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ], так и их взаимосвязь с генетическими заболеваниями [ Lehmann A.R., 1995 , Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 , Knudson A.G., 1991 , Barnes D.E., Lindahl T., ea., 1993 , Cleaver J.E., 1994 ].

Повреждение систем репарации приводит к резкому увеличению частот мутаций. Например, клетки рака толстой кишки проявляют высокую степень микростаеллитной нестабильности . При этом в них также в сотни раз повышается частота других мутаций, они имеют мутаторный фенотип . Далее см Отступление о скорости мутирования у бактерий

По крайней мере в одном из видов опухолей, (опухоль тостой кишки) в которой мутирован ген, ответственный за репарацию hMSH2 , мутации как раз и накапливаются в период сильно пониженной пролиферации. При этом скорость их накопления в несколько дестков и даже тысяч раз выше, чем в нормальных клетках.

Изменения систем репарации характерны, по-видимому, для относительно небольшой части новообразований. Однако при развитии некоторых форм опухолей они могут играть основополагающую роль. Так, врожденные дефекты генов, продукты которых ответственны за эксцизионную репарацию ДНК , вызывают пигментную ксеродерму - синдром, характеризующийся развитием множественных опухолей кожи в местах, подвергающихся солнечному облучению [ Cleaver, ea 1968 ]. Интересно, что, несмотря на участие эксцизионной репарации в исправлении дефектов, вызванных не только УФ-облучением, но и самыми разными мутагенами/канцерогенами [ Bol, ea 1998 , De Vries, ea 1997 ], частота возникновения других форм опухолей при пигментной ксеродерме почти не увеличивается. При этом у трансгенных мышей с аналогичными дефектами системы эксцизионной репарации отмечается повышение частоты индукции химическими канцерогенами опухолей внутренних органов [ De Vries, ea 1997 ]. Преимущественное возникновение у пациентов с пигментной ксеродермой опухолей кожи может указывать на незначительную роль химических факторов, загрязняющих окружающую среду, в развитии новообразований у человека [ Lengauer, ea 1997 ].

Врожденные дефекты другой репарационной системы, исправляющей ошибки репликации ДНК, которые приводят к неспаренным основаниямй ("mismatch repair"), вызывают синдром Линча . Главной чертой этого синдрома является развитие опухолей толстого кишечника (так называемый " наследственный неполипозный колоректальный рак ") и/или опухолей яичника [ Lengauer, ea 1997 , Lynch, ea 1997 ]. (Преимущественное возникновение именно опухолей кишечника при дефектах этой системы репарации, возможно, связано с высочайшим пролиферативным потенциалом клеток на дне кишечных крипт, что, естественно, ведет и к более частому появлению ошибок репликации.) Идентифицированы четыре гена - MSH2 , MLH1 , PMS1 и PMS2 , инактивирующие мутации в которых приводят к этому состоянию [ Lynch, ea 1997 , Lynch, ea 1997 , Angioli, ea 1998 ]. Маркером инактивации любого из этих генов является легко выявляемая нестабильность микросателлитных последовательностей ДНК [ Lengauer, ea 1997 , Kolodner, ea 1996 ]. Нарушения в системе репарации неспаренных оснований характерны и для некоторых форм спорадических (ненаследственных) опухолей: они обнаруживаются в 13-15% опухолей толстой кишки, раков желудка и эндометрия, но значительно реже (менее 2%) в других новообразованиях [ Lengauer, ea 1997 ].

Предполагается, что нарушения в системе репарации двунитевых разрывов ДНК, осуществляемой путем гомологичной рекомбинации, также могут приводить к развитию определенных форм опухолей. На это указывает тот факт, что супрессорные белки BRCA1 и BRCA2 , герминальные мутации которых ответственны за наследственные формы рака молочной железы и рака яичников [ Lynch, ea 1997 , Angioli, ea 1998 , Blackwood, ea 1998 ], обладают способностью образовывать комплекс с белком RAD51 - гомологом бактериального белка RecA , ответственным за гомологичную рекомбинацию, а инактивация ("нокаут") генов BRCA1 и BRCA2 приводит к резкому повышению чувствительности к g-облучению [ Bertwistle, ea 1998 , Marmorstein, ea 1998 , Zhang, ea 1998 ]. Однако пока окончательно неясно, действительно ли канцерогенез при нарушениях функции BRCA1 и BRCA2 обусловлен именно этими, а не какими-то другими их активностями. В частности, следует заметить, что репарация двунитевых разрывов ДНК происходит в определенные периоды клеточного цикла, остановка в которых резко увеличивает эффективность процесса. Не исключено, что способность белка BRCA1 повышать экспрессию p21WAF1/CIP1 через р53-зависимые и р53-независимые механизмы [ Ouchi, ea 1998 , Zhang, ea 1998 ] и, наоборот, подавлять трансактивационную способность белка Myc [ Wang, ea 1998 ] направлена именно на остановку клеточного цикла в поврежденных клетках.

Если нарушения репарационных систем и связанная с ними "нуклеотидная нестабильность" причастны к развитию относительно небольшого числа определенных форм опухолей, то "хромосомная нестабильность", вытекающая из нарушений нормальной регуляции клеточного цикла, характерна, по всей видимости, для подавляющего большинства солидных опухолей .

SOS-ОТВЕТ КЛЕТКИ

SOS-ответ клеток: введение

Концепция SOS-ответа явилась обобщением целого ряда необычных наблюдений, сопряженных с репарацией и мутагенезом у бактерий [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ].

SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза ДНК, вызванную повреждением ДНК, голоданием клетки или другими стрессовыми факторами. Это реакция клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. SOS-система - генетическая программа изменения ДНК путем ее мутагенной репарации или рекомбинации с целью адаптации клетки к изменившимся внешним условиям, результатом чего является наращивание ее эволюционного потенциала.

SOS-система у E. coli

При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или ошибочно кодирующий поврежденный участок ДНК наблюдается включение в синтезируемую цепь случайных или соответствующих мутантному участку нуклеотидов. Затем репликация ДНК продолжается в обычном режиме. Таким образом, появляются поврежденные участки ДНК.

У E. coli в ответ на повреждения ДНК происходит координированная экспрессия большого числа генов (прмерно 26 белков). Такая реакция бактериальных клеток на генотоксические воздействия получила название SOS-ответа , а процесс образования мутаций - SOS- мутагенеза. В индукции SOS-ответа у E. coli определяющую роль играют ген lexA и ген recA . Белок LexA является репрессором гена recA и более 20 других генов и оперонов, составляющих SOS-регулон . В ответ на повреждение ДНК или ингибирование репликации, при прохождении ДНК- полимеразой поврежденного участка ДНК вырабатывается SOS-сигнал.

Механизм SOS-индуцированного мутагенеза выяснен, хотя и далеко не во всех деталях [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 , Woodgate R., Levine A.S., 1996 ].

Как оказалось, этот механизм имеет не менее тонкую регуляцию, чем описанный выше "глобальный" SOS-ответ клетки, так как его задача - заставить ДНК-полимеразу пройти повреждение даже ценой ошибки. Однако, как только повреждение пройдено, "мутагенная репарация", восстанавливающая синтез ДНК и спасающая клетку от гибели, должна быть прекращена.

Предполагается, что рассматриваемый процесс развивается в два этапа. На первом PolIII вставляет случайное основание напротив поврежденного (или напротив сайта, лишенного основания); на втором комплекс белков UmuD' и UmuС помогает полимеразе продолжить синтез ДНК после этой случайной вставки. С этой целью в районе повреждения на ДНК формируется мультиферментный комплекс, так называемая " мутасома ", имеющая в своем составе белки UmuD', UmuC, RecA и голофермент PolIII. Белки UmuD и UmuC кодируются генами umuD и , образующими оперон так, что структурная часть гена umuD перекрывает один нуклеотид последующего гена umuC. образом, оба белка синтезируются координированно, причем концентрация белка UmuD оказывается всегда на порядок выше концентрации UmuC. Оперон umuDC находится под контролем SOS-блока, который по своему составу только на 3 н. отличается от идеального палиндрома. Это приводит к жесткой закрытости оперона, который открывается одним из последних при индукции SOS-функций и требует сильного SOS-сигнала. Белок UmuD имеет значительную гомологию с С-концевой частью белка LexA, в которой расположен сайт его авторасщепления, стимулируемого белком RecA. Последний так же, как и в случае L exA, способствует расщеплению UmuD и образованию активного полипептида UmuD', входящего в состав мутасомы. Время полужизни белков UmuD и UmuC в клетке составляет лишь 6-7 минут. Действительно, мономеры UmuD и UmuC взаимодействуют с протеазой Lon и деградируют. UmuD спасается от протеолиза в форме димера UmuD2. UmuC временно продлевает свое существование, защищаясь белками-шаперонами GroEL и GroES. Хотя UmuD' легко димеризуется и не является субстратом каких-либо протеаз, но этот мономер также легко образует гетеродимер UmuDD', который подвергается протеолизу ATP-зависимой сериновой протеазой ClpXP . Предполагается, что с помощью этого гетеродимера белки UmuD' выводятся из реакции. Такой сложный комплекс белок-белковых взаимодействий, схематически представленный на рис. 1а , имеет целью подавить возможность образования мутасомы при базальном уровне белков UmuD и UmuC в нормальной клетке (по 200 и 16 молекул на клетку соответственно) или в случае слабого SOS-сигнала. В случае сильного SOS- ответа, когда концентрация белков UmuD и UmuC возрастает на порядок, достаточно быстро возникает стабильный комплекс UmuD2'C ( рис. 1б ), который, предположительно, передает мономер UmuC на комплекс белка UmuD' и белка RecA* (активная форма), чтобы образовать искомую мутасому RecA* + UmuD'C + PolIII. При этом наиболее простой представляется следующая цепь событий: повреждение ДНК, остановка синтеза ДНК, деградация ДНК с образованием онДНК, запуск SOS-ответа, полимеризация белка RecA в присутствии ATP на онДНК в месте повреждения (т.е. образование активной формы RecA*), взаимодействие RecA* с белком UmuD, появление UmuD', взаимодействие UmuD' и PolIII для продолжения синтеза ДНК без коррекции дефекта.

Как видно, белок RecA принимает участие в трех разных событиях: он индуцирует синтез белков UmuD и UmuC, расщепляет UmuD до активной формы UmuD' и обозначает место сборки мутасомы. Однако в основе этих событий лежит лишь одно свойство белка RecA - способность образовывать активный филамент в составе тройного комплекса RecA::ATP::онДНК. Это же свойство оказывается достаточным, чтобы объяснить и другие события SOS-ответа, приводящие к изменчивости генома, такие, как повышенная частота рекомбинационных обменов, хромосомные перестройки и межвидовая рекомбинация.

По своим последствиям SOS-система является прямым антагонистом системы КНО - если последняя способствует сохранению точности воспроизведения генома, то первая способствует его изменчивости. Наиболее определенно этот антагонизм нашел свое выражение в межвидовой рекомбинации, осуществляющей "горизонтальный" перенос генетической информации. Как отмечалось выше, эта рекомбинация подавляется системой КНО. Однако она усиливается при индукции SOS-ответа вообще и повышенного синтеза белка RecA и белков RuvAB в частности [ Matic I., Rayssiguier C., Radman M., 1995 ] (комплекс RuvAB в ходе recA-зависимой рекомбинации осуществляет миграцию ветви ДНК даже через области ДНК с несовершенной гомологией). Более того, в отличие от внутривидовой рекомбинации межвидовая сопровождается recB-зависимой индукцией системы SOS [ Matic I., Rayssiguier C., Radman M., 1995 ]. В данном случае нуклеаза RecBCD выступает не только в роли "рекомбиназы", но и "ДНК-деградазы", что приводит к появлению индукторов SOS-ответа. Спрашивается, почему в природе сохранилась способность к межвидовой рекомбинации, поддерживаемая специализированной системой SOS? К настоящему времени стала очевидной наивность представлений о том, что эволюционная специализация генома или даже шоковая адаптация к изменившимся внешним условиям происходит путем постепенного накопления необходимого числа мутаций для перехода гена и его продукта в новое качество [ Gould S.J., Eldredge N., 1993, Gorshkov V.G., 1995 ]. Ясно, что только горизонтальный перенос блоков, составляющих гены, или даже целых генов, может обеспечить моментальное приобретение искомого качества. Гарантом сохранения вида является "дивергенция" нуклеотидной последовательности ДНК, которая используется системой ДКНО для предотвращения межвидовой рекомбинации. Отмечено, что у бактерий значительно меньшей дивергенцией обладают гены (до 35% генома), обмен которыми облегчает адаптацию к внешним условиям даже на фоне целостной системы MutHLSU. В природной популяции E. coli до 1% клеток имеют мутаторный фенотип [ Trobner W., Piechocki R., 1994 ]. Таково условие выживания данной популяции. В благоприятных же условиях число клеток-мутаторов снижается на несколько порядков. Следовательно, для постоянно идущего процесса эволюционной изменчивости более выгодны стрессовые ситуации, предусматривающие, в частности, межвидовой обмен генетическим материалом. Это и обеспечивает индуцибельная система SOS. Две противоположные по задачам системы - MutHLSU и SOS - создают возможность поддержания изменчивости клетки при сохранении ее видоспецифичности.

Итак, SOS-система - генетическая программа изменения ДНК путем ее мутагенной репарации или рекомбинации с целью адаптации клетки к изменившимся внешним условиям, результатом чего является наращивание ее эволюционного потенциала.

SOS-система у эукариот

Существует ли аналог SOS-системы бактерий у эукариот? Система ДКНО была выявлена у эукариот . RecA-подобные белки оказались универсальными [ Roca A., Cox M., 1997 ]. UmuC-подобные белки найдены у ряда эукариот [ Woodgate R., Levine A.S., 1996 ]. Следовало бы ожидать выявления и других аналогов центральных генов системы SOS.

Однако, если принцип индуцированной изменчивости кажется приемлемым для низших эукариот, то для клеток млекопитающих его полезность не столь очевидна.

SOS-система: аналоги у дрожжей

Еще до 80-х гг. были предприняты попытки найти у эукариот экспериментальные подтверждения существования SOS- функций, описанные у бактерий. К числу таких относятся Вейгловская (W) реактивация (реактивация УФ-облученного бактериофага, усиленная индукцией SOS-функций в хозяйских клетках), W-мутагенез (усиление мутагенеза УФ-облученного фага за счет индукции SOS у хозяина), подавление SOS-функций ингибиторами протеаз и т.д. Однако результаты оказались неоднозначными. W-реактивацию наблюдали для ряда вирусов, таких вирусов как герпес, аденовирус, SV-40, ретровирусы, но ни у вируса осповакцины, ни у полиовирусов W-мутагенез не был найден. Кроме того, антипаин - известный ингибитор протеаз, который подавлял все известные SOS-функции у бактерий, не смог подавить W-реактивацию вирусов [ Radman M., 1980 ].

Становилось ясно, что эукариотическая клетка вряд ли слепо копирует структурную организацию SOS-системы прокариот. Однако ни прежние данные, ни данные последнего времени не исключают возможности функциональной аналогии.

У S. cerevisiae выявлено до 30 генов, индуцируемых агентами, повреждающими ДНК [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ], а более 20 генов образуют эпистатическую группу RAD6 так называемого "мутагенного пути репарации" [ Nicolaides N.C., ea, 1994 ].

SOS-система: аналоги у млекопитающих

У млекопитающих описано более 50 генов и их продуктов, активируемых на транскрипционном или посттранскрипционном уровнях, которые обеспечивают по крайней мере 3 вида ответов клетки на ДНК-повреждающие воздействия [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ].

1) ответ, контролируемый гетеродимерным комплексом АР-1 ;

2) ответ определяемый активацией фактора NF-kb , ответственного за стимулируемую УФ-светом транскрипцию генов ВИЧ-1; и

3) ответ, контролируемый транскрипционным активатором - белком р53 . Последний участвует в регуляции прохождения контрольных точек клеточного цикла (checkpoint control), включая остановку синтеза ДНК на стадии G1 и инициирование, если необходимо, апоптоза. Утеря функциональной активности белка р53 приводит к выраженной нестабильности генома, включая амплификацию генов, транслокации и анеуплоидию [ Lane D.P., 1982 ].