29. Микробиологический синтез аминокислот.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время высокоочищенных препаратов аминокислот получают этим способом. Главное преимущество которого состоит в возможности получения аминокислот на основе возобновляемого сырья. Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительных кол-в какой-либо одной аминокислоты. При этом было подмечено, что продуктивные штаммы можно улучшать посредством селекции мутантов с измененной генетической программой. Это роды Brevibacterium, Micrococcus, Corinebacterium, Arthrobacter.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы – глюкоза, сахароза, реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье – свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. В качестве источников азота применяют мочевину, соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для успешного роста микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. В питательную среду добавляют некоторые макро- и микроэлементы: P, Ca, Mg, Mn, Fe и др. На процессы биосинтеза существенное влияние оказывает аэрация, при этом степень снабжения воздухом индивидуальная для каждой конкретной аминокислоты.

Исходным материалом для синтеза аминокислот служат простые промежуточные продукты катаболизма (пируват, 2 - оксиглутарат, оксалоацетат и фумарат, эригрозо - 4 - фосфат, рибозо - 5 - фосфат и АТР ). При синтезе большинства аминокислот аминогруппа вводится только на последнем этапе путем трансаминирования. Некоторые аминокислоты образуются в результате ряда превращений других аминокислот, и в этих случаях трансаминирование не требуется.

Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов, то есть размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем - на жидкой среде в колбах, инокуляторах и посевных аппаратах, а затем в головных (основных ) ферментаторах. Обработку культуральных жидкостей и выделение аминокислот проводят по схеме, аналогичной схеме получения антибиотиков. Изолированные чистые кристаллы целевого продукта обычно высушивают под вакуумом и упаковывают.

Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный полиауксотрофный штамм - продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют

В двухступенчатом способе микроб - продуцент культивируют в среде, где он получается и синтезирует все необходимые ингредиенты для последующего синтеза ( в идиофазу ) целевого продукта.

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, то после 1 - ой ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клетки.

Технологический процесс биосинтеза лизина двухфазный:

В первой фазе в специальных посевных аппаратах идет рост культуры клеток микроорганизма в течение суток при температуре 28-30оС и рН 7,0-7,2.

На второй стадии, которая начинается со средины экспоненциальной фазы роста клеток, биомассу подают в производственный ферментатор, заполненный питательной средой, где происходит синтез лизина. Процесс длится 2-3 суток. Уровень накопления аминокислоты 50-100г/л. Лизин секретируется в культуральную жидкость. Культуральную жидкость отделяют фильтрованием. Высокоочищенную субстанцию лизина получают фракционированием фильтрата с последующей ионообменной хроматографией на катионите. Элюируют лизин раствором аммония гидроксида. Элюат концентрируют под вакуумом при температуре 60^оС, переводят в форму монохлоргидрата, Лизин сушат и подвергают перекристаллизации. В результате получают субстанцию лизина 97-98%.

Получение аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток: Экономически целесообразным являются способы получения аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Сравнительно давно реализован процесс получения L - аспаргиновой кислоты из фумаровой и аммиака в одну стадию с помощью иммобилизованных клеток Е. coli или Pseudomonasaeruginosa, обладающаяаспартазной активностью

Промышленный синтез аминокислот:

Мировая промышленность производит в больших объемах глутаминовую кислоту, метионин, лизин, глицин, триптофан и другие аминокислоты для получения кормовых препаратов, специальных продуктов питания и лекарств.

При микробиологическом синтезе образуются L-аминокислоты, обладающие биологической активностью.

Микробиологический синтез основан на выращивании определенных видов микроорганизмов на питательных средах, имеющих подходящий источник углерода. Чаще всего это сахара, содержащиеся, например, в патоке. Мутированные микроорганизмы с нарушенным азотным обменом выделяют в раствор большое количество какой-либо одной аминокислоты. После окончания процесса ферментации аминокислоту выделяют из раствора химическими методами

Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры.

Ауксотрофные мутанты микроорганизмов, лишенные в результате действия мутагенов, ряда ферментных систем, признаны наиболее ценными продуцентами. Блокада у таких мутантов соответствующих реакций в цепи обмена веществ приводит к сверхсинтезу одного из метаболитов.

Технологически современный процесс М. с. состоит из ряда последовательных этапов (операций). Главные из них: подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента; подготовка питательной среды; выращивание посевного материала; культивирование продуцента в заданных условиях, в ходе которого и осуществляется М. с., часто называемый ферментацией (например, ферментация антибиотиков); фильтрация и отделение биомассы; выделение и очистка требуемого продукта, когда это необходимо; сушка. Процессы выделения и очистки, часто занимающие важное место среди др. технологических операций, определяются химической природой получаемого вещества и могут включать экстракционные и хроматографические методы, кристаллизацию, осаждение и др. Наиболее прогрессивным способом культивирования считается непрерывный — с непрерывными подачей питательной среды и выводом продуктов М. с. Так производят, например, микробную биомассу (кормовые дрожжи).

Регуляторные мутанты отбирают среди культур, устойчивых к аналогу целевой аминокислоты. С этой целью исходный штамм (часто это ауксотроф) высевают газоном на минимальную среду, содержащую источник углерода, неорганические соли и аналог целевой аминокислоты. Последний действует на регуляторную систему клеток, имитируя избыток соответствующей природной аминокислоты, антагонистом которой он является; обычно вклю­чаться в белок аналог не может, и, следовательно, рост куль­туры прекращается. Этот метод позволяет отобрать мутанты, у которых имеются нарушения в системе регуляции образования целевой аминокислоты, а некоторые из них оказываются способ­ными к ее повышенному синтезу и выделению из клетки.