43.Биотехнологическое получение интерлейкинов

Интерлейкины — сравнительно короткие (около 150 амино­кислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Интерлейкин-1, образующийся опре­деленной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов (субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2.Последний вызывает пролифера­цию различных субпопуляций Т-лимфоцитов — Т-киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высво­бождаются регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы; синтезируются также интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах, получают путем клонирования соответствующих генов в Е. coll или культивирования лимфоцитов invitro.

ИФН - это группа эндогенных гликопротеидов с м.м. около 3000, которые оказывают неспецифическое противовирусное действие, влияя на клеточные метаболические процессы синтеза РНК и белка. Первона­чально было установлено, что ИФН вырабатывают клетки, инфициро­ванные вирусами (тип I); в дальнейшем - что ИФН вырабатывают так­же лимфоциты в ходе иммунной реакции (тип 2).

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения ДНК ИФН-ов состоит в следующем:

• Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

• Полученным продуктом трансформируют Е. coli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют. Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.

• Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и кРНК, выде­ляют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка. Определяют интерферонную противовирусную активность каж­дой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, про­явившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифици­руют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК че­ловека.

ИФН проявляют некоторые виды активности как лимфокины и им­муномодуляторы. ИФН I типа, действующие преимущественно как ин­гибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стиму­лируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной __мРНК и синтез вирусных белков.

44. Иммунобиотехнология как раздел биотехнологии. Вакцины: понятие, характеристика, классификация, требования. Методы получения вакцин.

Иммунобиотехнология — это раздел современной биотехнологии, представленной как научными достижениями, так и динамично развивающимся технологическим производством диагностических, профилактических и лекарственных средств с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной системы.

Иммунобиотехнология объединяет производства вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуномедиаторов. Иммунобиотехнология основана на реакции антиген (АГ)- антитело (АТ).

Вакцины – это препараты, приготовленные из убитых или ослабленных болезнетворных микроорганизмов или их токсинов. Как известно, вакцины применяются с целью профилактики или лечения. Введение вакцин вызывает иммунную реакцию, за которой следует приобретение устойчивости организма человека или животного к патогенным микроорганизмам.

Если рассмотреть состав вакцины, то в них входят:

- действующий компонент, представляющие специфические антигены,

- консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении,

- стабилизатор, который продлевает срок годности вакцины,

- полимерный носитель, который повышает иммуногенность антигена (АГ).

Под иммуногенностью понимают свойство антигена вызывать иммунный ответ.

В роли антигена можно использовать:

1. живые ослабевшие микроорганизмы

2. неживые, убитые микробные клетки или вирусные частицы

3. антигенные структуры, извлеченные из микроорганизма

4. продукты жизнедеятельности микроорганизмов, в качестве которых используют токсины, как вторичные метаболиты.

Требования к вакцинам: 1) Безопасность - вакцины не должны быть причиной заболевания и смерти; 2) Протективность - вакцины должны защищать против заболевания; 3) Поддержание протективного эффекта-защитный эффект должен сохранятся в течение нескольких лет; 4) Относительно низкая цена вакцин, легкость применения, широкий эффект.

Классификация вакцин в соответствии с природой специфического антигена:

• живые

• неживые

• комбинированные.

Рассмотрим более подробно каждую из них.

1. Живые вакцины получают

а) из естественных штаммов микроорганизмов с ослабленной вирулентностью для человека, но содержащий полный набор антигенов (в качестве примера можно привести вирус оспы).

б) из искусственных ослабленных штаммов.

в) часть вакцин получают генноинженерным способом. Для получения таких вакцин используют штамм, несущий ген чужеродного антигена, например, вирус оспы со встроенным антигеном гепатита В.

2. Неживые вакцины – это:

а) молекулярные и химические вакцины. При этом молекулярные вакцины конструируют на основе специфического антигена, который находится в молекулярном виде. Эти вакцины могут быть получены и путем химического синтеза или биосинтеза. Примерами молекулярных вакцин являются

анатоксины. Анатоксины – это бактериальный экзотоксин, потерявший токсичность в результате длительного воздействия формалина, но сохранивший антигенные свойства. Это дифтерийный токсин, столбнячный токсин, бутулинический токсин.

б) корпускулярные вакцины, которые получают из целой микробной клетки, которая инактивизирована температурой, ультрафиолетовым облучением или химическими методами, например, спиртом.

3. Комбинированные вакцины. Они комбинируются из отдельных вакцин, превращаясь при этом в поливакцины, которые способны иммунизировать сразу от нескольких инфекций. В качестве примера можно назвать поливакцину АКДС, содержащую дифтерийный и столбнячный анатоксины и коклюшные корпускулярные антигены. Эта вакцина, как известно, широко применяется в детской практике.

Классификация вакцин может быть представлена и по виду лекарственной формы:

- иньекционные (жидкие)

-пероральные (таблетки, капсулы, драже)

- ингаляционные (аэрозоли).

Получение вакцин

1. вакцины живые

1.1.живые бактерийные вакцины. Этот тип вакцин получается наиболее просто. В ферментере выращиваются чистые ослабленные культуры. Существует 4 основных стадии получения живых бактерийных вакцин:

- выращивание

- стабилизация

- стандартизация

- лиофильное высушивание.

В этих случаях штаммы продуцентов выращиваются на жидкой питательной среде в ферментере вместимостью до 1-2 м кубические

1.2. живые вирусные вакцины. В этом случае вакцины получают путем культивирования штамма в курином эмбрионе или в культурах животных клеток.

2. молекулярные вакцины. Чтобы иметь представление об этом типе вакцин, надо знать, что в этом случае из микробной массы выделяют специфический антиген или экзотоксины. Их очищают, концентрируют. Затем токсины обезвреживают и получают анатоксины. Очень важно, что специфический антиген может быть также получен путем химического или биохимического синтеза.

3. корпускулярные вакцины. Их можно получить из микробных клеток, которые предварительно культивируют в ферментере. Затем микробные клетки инактивируют температурой, или ультрафиолетовым облучением (УФ), или химическими веществами (фенолами или спиртом).

45. Рекомбинант вакцины

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать новое поко­ление вакцин более безопасных и эффективных, менее дорогих, не имеющих ограничений в применении. При этом используют разные подходы:

1. Патогенный микроорганизм модифицируют, (убирая) гены, ответственные за вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызывать иммунный ответ. Получаются жи­вые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, кото­рые не могут становиться патогенными.

2. Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные (белки) патогенных микроорганизмов, экспрессиру­ют в альтернативном хозяине, например Е. coli, получают нуж­ный продукт в большом количестве и используют его как вакци­ну. Такие вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты па­тогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцина­ми. Достоинства субъединичных вакцин состоят в том, что пре­парат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могут быть причиной нежелательных побочных эффектов в организме- хозяине. Недостатки субъединичных вакцин - очистка специ­фического белка высока по стоимости; его конформация после выделения может отличаться от той, которую он имеет in situ (т.е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может повлечь изменение его антигенных свойств.

3. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детер­минанты патогенного организма, встраивают в геном непатоген­ного носителя (обычно вируса) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Жи­вые вакцины, как правило, более эффективны, чем неживые или субъединичные.

Одним из новых направлений создания рекомбинантных вакцин яв­ляется разработка ДНК-вакцин (так называемых генных, полинуклео-тидных вакцин, вакцин из нуклеиновых кислот). Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят моле­кулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки пато­генного организма и генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариотов (человека). В качестве про­дуцентов таких генов используют бактериальные клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды с соотвествующими генами. После получе­ния достаточной биомассы (количества копий) плазмидную ДНК выде­ляют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Полу­ченную ДНК-вакцину вводят парентерально, при этом большая ее часть поступает в межклеточное пространство, после чего включается в клетки.