40. Инсулин

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и

проинсулин переходит в активный инсулин. Есть разные способы получения инсулина.

Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого

скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя

рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин

41. Интерфероны

Интерфероны — общее название, под которым в настоящее время объединяют ряд белков со сходными свойствами, выделяемых клетками организма в ответ на вторжение вируса.

Интерфероны человека подразделяют на группы в зависимости от типа клеток, в которых они образуются: α (выделяется белыми кровяными клетками – лейкоцитами Т и В), β (выделяется белыми кровяными клетками – лейкоцитами Т и В), γ(продуцируется Т-клетками и естественными киллерами), что соответствует прежним обозначениям лейкоцитарного, фибробластного и иммунного интерферонов соответственно и ω(омега) выделяется лейкоцитами в месте вирусных инфекций и опухолей. Само слово "интерферон" принято сокращать IFN.

По способу получения интерфероны делятся на:

1.Природные, получаемые из культуры клеток лейкоцитов человека, стимулированных вирусами.

2.Рекомбинантные, продуцируемые бактериями со встроенным геном интерферона в их геном.

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichiapastoris, Pseudomonasputida и Escherichiacoli.

Этапы:

1. получение рекомбинантной мультикопийной плазмидной ДНК, кодирующая синтез лейкоцитарного α-2b интерферона человека, экспессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клетки реципиентного штамма E.coli получен штамм E.coli продуцент рекомбинантного лейкоцитарного α-2b интерферона человека.

2. глубинное культивирование на пит среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении пит субстратов в процессе биосинтеза.

3. Механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком росте, растворение агрегированного белка в концентрированном расворегуанидина гидрохлорида с последующейренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов.

4. очистка с использованием 3-х стадийной хроматографической очистки с иммобилизированными ионами Сu ионообменной хроматографией на ионнообменных смолах и гель фильтрационной хроматографией. Позволяет получать субстанцию интерферона чистотой более 99%.

Генноинженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения интерферона включает следующие этапы: 1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона;

2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК;

3) получение суммарных комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы;

4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование;

5) отбор клонов, содержащих гены интерферона;

6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена;

7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка;

8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

42. Биотехнологическое производство рекомбинантного гормона роста

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию — гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Сома­тотропин способствует заживлению ран и ожогов, наряду с кальцитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са²⁺ в костной ткани. Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофи­за трупов, но в недостаточном количестве (каждый гипофиз содержит его не более 4 мг). В то же время для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в неделю; курс лечения должен продолжать­ся несколько лет. С применением генноинженерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Основные производители — Швеция, Италия, Швейцария и США.

Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка.

Весь технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов: 1) ферментация;

2) первичная очистка белка;

3) хроматографическая очистка;

4) изготовление лекарственной формы;

5) анализ качества субстанции и лекарственной формы соматогена.

Важной особенностью технологического процесса является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка.

В настоящее время разработан более совершенный препарат СТГч из ГТЧ, лишенный агрегированных форм и консерванта, - аусоматин. При производстве мономерных препаратов СТГч (например, аусоматина) получаются значительные количества агрегированных форм соматотропина в виде отходов производства. Разработан оригинальный способ превращения нековалентно связанного димера и полимера в мономер. Кроме того, во время этого процесса получаетсяковалентно связанный димер и полимер СТГч - мало изученные компоненты.

Разработан оригинальный способ получения иммобилизованного СТГч, обладающего пролонгированным действием. Длительное лечение (годами) одним препаратом СТГч вызывает в организме уменьшение чувствительности к нему.