Биотехн как науч дисцип. Опред-я. Генетичес связь с др науками. Этапы станвол-я биотехн.

БТ – 1. Обл-ть промыш произ-ва ТиУ при участии жив орг-ов, биол сист и процессов. 2. Комплек. прим-е биохим, микробиол, инженер знаний с целью промыш исп-я потенц. возмож-ей микроорг, культур кл.

Этапы развития: эмперич, науч, молекуляр.

Эмперич – человеч-во испол-ло м/о с незапамят времен. Технол получ пива, вина, сыра и тп

Науч этап основыв на работах Пастера. Позже был введен термин «БТ» в 1918 Эрики.

1943 – пенциллин

1953 – Уотсон и Крик опред структуру ДНК

1988 – метод ПЦР

Молекул этап – разделение биотех на неск отраслей – медиц, промыш, эколог, пищ, с/х

2. Виды биол объектов, примен в биотех, классиф, хар-ка

БО – центр и обяз элемент биотехн произ-ва.

БО: целый орг-м (химерн жив, раст, чел-к), отдел кл (эу-, прокариот), фермент реак (получ ВМС)

3. Ферм как биол объекты. Класс. Хар-ка. Сферы практич прим-я

Ферм – катализатор биол происх. Они высоко активны и специфичны. 1 ферм = 1 реак.

Класс ферм реак: 1. окис и восст. - оксиредуктазы 2. перенос функц групп - трансферазы 3. гидролиз - гидролазы 4. реак с участием двойн связей – лиазы 5. изомеризация - изомеразы 6. синтез слож соед с испол АТФ - лигазы

Ферм – прост (белок), слож (белок+небелк часть = апофермент+простетич группа)

Применение

Некоторые ферменты применяют в качестве лечебных препаратов:

Пепсин – при нарушении синтеза и секреции пепсина в желудке;

Трипсин, химотрипсин используются для лечения гнойных ран;

Фибринолизин, стрептокиназа – для предотвращения тромбообразования при пересадке органов и других операциях;

Гиалуронидаза обеспечивает рассасывание рубцов;

Аспарагиназа применяется при лечении некоторых злокачественных образований и т.д.

При отсутствии или недостатке тех или иных ферментов, связанных с мутацией гена, ответственного за синтез белка – фермента, возникают наследственные энзимопатии.

4. Селекция. Методы селекции, их характ. Практ примен рез-ов селек в БТ.

СЕЛЕКЦИЯ – естест отбор. отбор м/о с нужной мутацией или признаком.

микроорганизмы как объект селекции имеют ряд особенностей:

1) выращивание микробной культуры из одной клеткиприводит к тому, что в качестве исходного материала селекции всегда оказывается особь клона (имеющего генетическую одно образность). С другой стороны, клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счет естественных мутаций превращается в популяцию — совокупность клеток с разными генотипами;

2) большинство микроорганизмов гаплоидные, с одним экземпляром хромосом, поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;

3) у большинства микроорганизмов, имеющих промышленное значение, до сих пор не известна способность к гибридизации (половому размножению). Это означает, что селекцию клеток можно вести только вегетативным путем;

4) микроорганизмы характеризуются исключительно быстрой сменой поколений, поэтому возможностей для отбора положительных экземпляров у селекционера-микробиолога значительно больше.

5) селекционер микроорганизмов имеет огромное число индивидуумов для отбора, что принципиально расширяет его возможности, но для оценки продуктивности каждого клона требуется трудоемкая работа, часто с применением ряда химических и биохимических анализов.

Мутации затем селекция

5+6. Конструир новых продуцентов ЛВ с пом методов клеточ инженерии

клет инжен – техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом и хромосомами независимо от удаленности орг-ов в эвалюц плане

техника протопластирования

протопласт – кл без клет обол, окруж цитоплазм мембр

1. выбор БО – БО, подуцир целевой продукт и БО, кот хотят придать св-во продуц-ть целев продукт

2. обработка кл стенок фермен

3. стабил протопластов в гипертон р-ре из маннита, сахарозы и хлорида натрия

4. слияние протопл в ПЭГ. для облегч процесса клетки перед этим обрабат тяж Ме, или быстро заморажив и оттаивают, или обраб кл ферм. включ еще одного протопл, несущего маркер для отличия гибридов от ост кл

5. гибрид засев на плот питат ср, восст-ся кл стенка. отбор гибридов

6. хран гибридов

7. Этапы получ моноклон Ат. Хар-ка

1. иммуниз-я животн – повыш кол-ва кл, подуцир Ат заданной специф-ти и перевод кл в функц сост-е, при кот они могут слив-ся и производить Ат-продуц. кл. исп мышей балд/е, фактор Фрейбинга, адсорб-я Ат на квасцах. у мыши забирают кровь до титра в 100000 – метод лимитир разведений

2. культивир миелом кл – внутрибрюшинно минер масло в мышей. миелом линия дБ проверена на спос-ть к слиянию. после разморозки кл исп в теч 1 мес. для слияния кл берут в догариф фазе роста, кол-во кл в культуре не более 0,5 млн. культив в присутст токич аналога нуклеотидов на среде ГАД

3. слияние миел кл с иммунизир спленоцитами

4. скрининг Ат

5. клониров-е гибрид кл ин виво, витро. ин витро в момент логари фазы роста не более 0,5 млн кл. ин виво в асцидной ж-ти брюш полости 20 мл на 1 мл

6. хр-е гибридов – в спец среде

8. Тех-я получ-я рекомбин белков. Этапы. Хар-ка. Сферы практ прим-я.

Инсулин

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и

проинсулин переходит в активный инсулин. Есть разные способы получения инсулина.

Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого

скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя

рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин

9. Генетич инженерия. Уровни. Хар-ка. Сущность. Созд-е высокоактив продуцентоа ЛВ.

Ген инжен – методы получ габрид ДНК из фрагментов геномов разн орг-ов введением их в клетку и обеспечивая услов-я для экспрессии генов. 1972 – 1 мол рекомбин ДНК

Этапы: 1. получ-е нужного гена (трансгена) из естест источ или хим путем

2. созд-е спец гентич констр-й – векторов, в составе кот гены будут внедряться в геном др вида

3. генетич трансформ-я – влюч-е рекомб ДНК в код хозяина

4. отбор клонов с рекомб ДНК с пом маркерных генов

5. выращив трансгенных орг-ов

Прим-ся для получ а/к, витамин, антибиот

10. Вектор в ген инжен. Классиф. Хар-ка. Треб к ним.

Вектор – мол ДНК, способная переносить вкл в них чужерод гены

Св-ва: 1. спос-ть к автоном реплик в кл

2. наличие сайта, в кот встраивается желаемый фрагмент ДНК или 2 участка, чувствит к опред рестриктазе, кот расщепл вектор и позволяет встраивать трансген.

3. наличие маркера, благодаря кот кл будут обладать новыми св-ми

4. наличие промотера для экспрессии гена

Векторы: плазмиды – внехромосом гентич элем эукариот, кот свободно реплицир в кл

фазовые векторы – созд-ся на абзе умерен бактериофага, создающего двуцепочеч линей мол ДНК

космида – векторная плазмида, предназнач для клониир бол фрагментов ДНК клетках Е.соli

челночн векторы – векторы, способн реплицироваться в кл нескол орган-ов

11. Основы хим, хим-ферментатив и ферментатив синтеза фрагментов ДНК

Им 3 сп-ба пол-ия таких фр-нтов:1. Самый простой-природн: ДНК(извл из живых кл-к) 2.химико-ферментативн с-з генов (в нашей стране-20 лет назад - с-з лейкоцит. интерферона) нужно знать нуклеот посл-сть либо а/к-тную посл-сть белков.3.обратная транскрипция с м-РНК. Этим сп-бом польз в тех сл-ях, когда необх-мо перенести фр-нт ДНК эукариотич орг-в к прокариотическим. Обр-я тр-ция- с-з ДНК с м-РНК. Дан пр-сс был подсмотр в пр-де (у онкогенных вирусов)

Гены им опр чередующ уч-ки-экзоны и интроны. Экзоны-уч-ки, нафаршир триплетами, кодир-ми а/к-тные посл-сти. Интроны- не код ни одной а/к-ты. С-з м-РНК с теми же интронами и экзонами. При появлении интрона прекр-иясчитывания инф-ции. Уч-ка после транскрипции РНК на рибосомы не идёт. Опр ф-нты вырезают интрон зоны, и зрелая м-РНК идёт на рибосомы. У бактрер кл-ки таких процессов нет. Для 3-его сп-ба исп-ют зрелые м_РНК. Вырезают интронные зоны ф-нты рестиктазы. Они разрезают ДНК в строго опр-м месте. У бакт выд >500 разл рестиктаз.

Современные методы химического синтеза нуклеиновых кислот позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в том числе целые гены. Методические основы химически - ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной.

Они включают:

1. химический синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из которых затем в результате комплементационных взаимодействий выстраиваются дуплексы - фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях;

2. соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетически однотяжевых олигонуклеотидов проводят в несколько этапов. Сначала собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (однотяжевыми комплементарными участками), из которых затем последовательно формируют более протяженные структуры. Таким образом могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетической инженерии возможно клонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусственных ДНК.

Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонуклеотидов явилась разработка так называемого фосфотриэфирного метода. Образующийся динуклеотид после частичного деблокирования фосфата конденсируют аналогичным образом с другими динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в котором используют защиту фосфатной группы, позволило значительно сократить время синтеза и повысить выходы олигонуклеотидов.

Параллельно этим методам, которые осуществляют в растворах, разрабатывались твердофазные способы синтеза нуклеиновых кислот. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в растворе.

Наиболее распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р (III). В так называемом амидофосфитном способе нуклеотидным компонентом является эфир 3'-амидофосфита дезоксинуклеозида. Достаточно устойчивые амидофосфиты при протонировании в присутствии тетразола превращаются в сильные фосфорилирующие агенты. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH2 гетероциклов. Липофильную группу (МеО) 2Тr удаляют после первого хроматографического разделения.

12. Ферменты в генной инжен (рестриктазы, лигазы), мех-м дей-я

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием).

Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными:

Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго

Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности.

Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

Лигаза (лат. ligāre — сшивать, соединять) — фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул.

В молекулярной биологии лигазы подкласса классифицируют на РНК-лигазы и ДНК-лигазы.

У млекопитающих классифицируют три основных типа ДНК-лигаз.

ДНК-лигаза I лигирует фрагменты Оказаки в ходе репликации отстающей цепи ДНК и участвует в эксцизионной репарации.

ДНК-лигаза III в комплексе с белком XRCC1 участвует в эксцизионной репарации и в рекомбинации.

ДНК-лигаза IV в комплексе с XRCC4 катализирует окончательный этап негомологичного соединения (non-homologous end joining - NHEJ) двунитевых разрывов ДНК. Также требуется для V(D)J рекомбинации генов иммуноглобулинов.

13. Треб-я сист glp, gcp, gmp к организ-ии и реализ-ии боитех произ-в

GLP – (Good Laboratory Practice) – хорошая лабораторная практика – правила организации лабораторных направлений.

GCP – (Good Сlinical Practice) – хорошая клиническая практика – правила организации клинических испытаний.

GMP – ( Good Manufacturing Practice) – хорошая производственная практика – правила организации производства и контроля качества лекарственных средств, это единая система требований к производству и контролю.

Правила GMP – это руководящий, нормативный документ, которому и производство и фирма обязаны подчиняться. Правила GMP обязательны для всех предприятий, выпускающих готовые лекарственные формы (ГЛФ), продукцию медицинского назначения, а также субстанции.

Правила GMP имеют 8 разделов

I Терминология

П. Обеспечение качества

Ш. Персонал

IV Здания и помещения

V Оборудование

VI Процесс производства

VII Отдел технического контроля (ОТК)

VIII Валидация (утверждение)

GLP – правила организации лабораторных исследований

Новое лекарственное средство необходимо подвергнуть лабораторным испытаниям, прежде чем приступать к проведению клинических испытаний. Лабораторные испытания ( in vitro, in vivo) проводятся на клетках, бесклеточных системах и животных. При испытании на животных можно получить различные результаты, поэтому важна правильная организация исследований. Животные должны быть гетерогенны (разные), корм должен быть постоянным, одинаковым; требуется определенная планировка вивария, чтобы исключить стресс у животных; животные должны быть жизнеспособны.

GCP – правила организации клинических испытаний

Лекарственное средство допускается к клиническим испытаниям только после проведения лабораторных испытаний. В правилах GCP изложены права больных и добровольцев:

- испытуемые должны быть информированы о том, что им вводится новый лекарственный препарат и о его свойствах

- больные имеют право на финансовое вознаграждение

- должен быть контроль за ходом испытаний со стороны медиков.

В Европе, Соединенных Штатах Америки (США) и России введены общественные комитеты по контролю за клиническими испытаниями лекарственных препаратов. В эти комитеты входят священники, представители милиции и прокуратуры, медицинской общественности, которые наблюдают за испытаниями лекарственных препаратов. Цель клинических испытаний - получение достоверных результатов: лекарство лечит, оно безвредно и т.д.__