9 Получение высокопродуктивных штаммов. Селекция продуцентов биологически активных соединений. Метод получения генетических рекомбинантов

Промышленно важные продукты жизнедеят-ти м-о по их природе и по значению их для самоц клетки делятся на 3 группы: 1) крупные молекулы типа ферментов, полисахаридов с М>10 тыс и до миллионов; 2) первичные метаболиты: аминокислоты, пуриновые, пиримидиновые основания, витамины; 3) вторичные метаболиты: антибиотики, токсины, алкалоиды, факторы роста растений и т. д. первичные и вторичные метаболиты получены путем микробного синтеза и имеют низкую М= менее 1,5 тыс. биологическая активность различна. Одни удовлетворяют потребностям человека и животного, другие направлены на м-о, насекомых, 3-и учавствуют в выведении новых сортов растений. Чтобы такие продукты стали объектом промыш-го произ-ва, ими должны выделяться клетки в питат-ю среду и накапливаться в количествах, кот. оправдывали сырьевые и энергетические затраты на культивирование м-о, на выделение продуктов из среды. Природные штаммы не синтезируют никаких вещ-в в излишних количествах, поэтому сами вещ-ва ингибируют ферменты, ответственные за их образование в клетке. В случае перепроизводства продуктов метаболизма природная клетка может погибнуть, поэтому природные штаммы подвергаются селекционной работе, чтобы заставить клетки осуществлять сверхсинтез ЦП и не гибнуть длительное время, что возможно за счет более активного выделения продукта из клетки в культуральную жидкость. Задача селекционеров: усиление природной способности м-о продуцировать нужное вещ-во, но и создание продуцента заново из штамма данного типа, не синтезировавшего это вещ-во впринципе. Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов последующих измерений мутаций, приводящих к усилению природной способности м-о синтезировать и продуцировать определенные вещ-ва. Появление способности синтезировать вещ-во в избытке сверх своих потребностей – цель селекционеров под уже мутантными штаммами, дальнейшее повышение уровня продукции целевого вещ-ва продуцента.

Теоретически мутации, приводящие к сверхсинтезу ЦП могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих все этапы синтеза, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих изменениях метаболизма: 1)↑ скорости поглощения и утилизации субстрата клеткой; 2) ↑ уровня биосинтеза фермента или их активностию это возможно за счет нарушения негативного контроля синтеза и активности регулирующих ферментов; 3) блокирование побочных реакций синтеза для ↓ расхода общих предшественников на синтез других метаболитов; 4) блокирование внутриклеточного превращения продукта, если оно должно происходить; 5) обеспечение эффективной экскреции продукта из клетки; 6) блокирование деградации продуктов в клетке; 7) усиление позитивных форм регуляции синтеза продукта, если желаемым продуктом является выделенный клеткой фермент. Тогда мутации, способные к усиленному их образованию и ↑ активности и накопление его в среде будут затрагивать следующее: структурный ген, приводя к синтезу мутантного фермента, не чувствит-го к ингибированию конеч-м продуктом, т.е. ↑его активности; гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции синтеза данного фермента; гены, кодирующие ферменты, кот. могли бы иноктивировать нужный фермент; гены, ответственные за синтез компонентов клеточных мембран, кот. отвечают за выведение продукта наружу. Не любая из перечисленных мутаций может привести к сверхсинтезу ЦП, чаще всего требуется сочетание нескольких. Среди них могут быть главные и вспомогательные. Вспомогательные нужны для проявления или наибольшего выражения главных.

Схема селекционной работы с продуцентами БАВ:

Продуцирует БАВ

^*- обработка мутагеном может предшествовать всем этапам отбора.

Метод получения генетических рекомбинантов: метод предполагает изменение генетического кода клетки за счет встраивания новых участков, кодирующих нужное свойство с последующим считыванием их в общем генетическом коде клетки при ее размножении. Новые участки могут появляться различными путями: в половом процессе размножения при обмене генетическими участками; с помощью векторов (кольцевые плазмиды ДНК или вирусы, бактериофаги). Чтобы вектор имел нужный генетический участок, его нужно туда встроить, подействовав на его ДНК сначала растригивающими ферментами, затем фер-ми, склеивающими ее с встроенными участками (лигазы). Затем вектор изымается из родной клетки и переносится в клетку, где нужно закрепить нужные свойства. В новой клетке повторяется растригивание и склеивание с родной ДНК клетки и культивирование ее с проверкой появились ли в ней целевые свойства и закреплены они или нет в следующих поссажах. В селекции продуцентов БАВ генетические рекомбинанты не получили широкого распространения. Развитие метода ограничилось отсутствием у большинства м-о БАВ, систем генетического обмена. Метод развитие получил при появлении метода слияния протопластов (клетка без клеточной стенки, покрытая плазмической мембраной, шарообразные формы, клеточная стенка удаляется пенициллином). После получения протопластов их можно слить и получить гибридный протопласт, запрещенный в природе, восстановить клеточную стенку, получить гибридные клетки, затем размножить их дальше. Достоинства метода – возможность совмещения в одном геноме различных мутаций из различных родственных штаммов не используя мутагенную обработку и поиск нужной мутации у исходного штамма. Результаты метод дал в селекции продуцентов аминокислот и антибиотиков, при получении межвидовых и межродовых гибридов.

10. Мутагенез и отбор при получении высокопродуктивных штаммов. Мутагенные факторы при получении высокопродуктивных штаммов. Подготовка исходного штамма к селекционной работе. Отбор случайных непредсказуемых мутаций.

Пригодность микроорганизма для использования в кач-ве объекта селекции на получение продуцента необходимого в-ва можно проверить, введя ему одну или несколько определенных, легко тестируемых мутаций. выбор исходного штамма предрешен спос-тью природного микроорганизма продуцировать какое-то кол-во нужного в-ва. В тех случаях, когда одно и то же в-во выделяют природные штаммы, относящиеся к разным таксономическим группам (например, грибы и бациллы), это может позволить выбрать более «технологичный» для будущего про-ва или более поддающийся селекции штамм.

Продукты микробного синтеза чтобы стать объектом рентабельного промышленного про-ва, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в кол-вах, которые оправдывали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизма и выделение продукта.Природные штаммы микроорганизмов, как правило, не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, т. е. продуцировать, значительное кол-во нужного продукта (кол-во этих в-в строго ограничено и рассчитано на потребности самой клетки).

Селекционеры получают у природных штаммов наследственных изменений – мутаций, приводящих к усилению природной спос-ти микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное в-во, а также появлению новой спос-ти - синтезировать в-во в избытке - сверх своих потребностей и продуцировать его.

Результат мутаций может проявиться в изменениях метаболизма клетки: 1) повышение скорости поглощения и утилизации субстрата клеткой; 2) повышение уровня синтеза биосинтетических ферментов или их активности; 3) блокирование побоч. реакций синтеза для снижения расхода общих предшественников на синтез других метаболитов; 4) блокирование дальнейшего внутриклеточного превращения продукта, если оно происходит; 5) обеспечение эффективной экскреции продукта из клетки; 6) блокирование деградации продукта.

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ. Разнообразные типы мутаций получают с помощью физ-их и хим-их мутагенных факторов. Биологический материал, подвергаемый воздействию мутагенных факторов, должен быть дискретным и содержать минимальное кол-во ядер. Обычно это споры, вегетативные клетки или даже обрывки мицелия у неспорулирующих организмов. 1)Физ-ми факторами (УФ-излучение и различные виды ионизирующей радиации) обрабатывают водную суспензию спор или клеток. 2)При обработке хим-ми факторами соблюдают условия, способствующие max проявлению мутагенной активности данного в-ва., обработку проводят в буферных растворах при наиболее эффективных для данного мутагена значениях рН. Выживаемость обрабатываемого микроорганизма зависит от дозы и чувствительности данного микроорганизма к летальному эффекту мутагена, В селекционной работе используются дозы, обеспечивающие выживаемость клеток в диапазоне от 0,1 до 50-80%.

МЕТОДЫ ОТБОРА МУТАНТОВ С ПОВЫШЕННЫМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ. имеются два пути: 1) отбор случайных мутаций после оценки данного колич-ного признака,; 2) отбор по данному кол-ному признаку среди мутантов с определенным фенотипом, для выделения которых из числа выживших клонов в каждом случае применяют собственный метод отбора.

(рис. Схема селекционной работы с продуцентами биологически активных веществ)

ПОДГОТОВКА ИСХОДНОГО ШТАММА К СЕЛЕКЦИОННОЙ РАБОТЕ. 1)После рассева исходного штамма на чашки Петри среди не менее 100 колоний выявляют типичную для данной культуры морфологическую форму и отклонения от нее .2) изолированные на косяки колонии (клоны) типичной формы (не менее 100 клонов) и ее морфологические варианты оценивают после культивирования по уровню продукции в-ва, применяя аналитический метод.. 3) Несколько клонов с наиболее высоким уровнем продукции по отношению к уровню контроля, отбирают и проверяют на продукцию в нескольких повторных опытах, а затем отбирают один клон 4)Отобранный клон снова рассевают, отмечают морфологическую изменчивость (если она есть) и затем оценивают по уровню продукции не менее 100 типичных для данного клона изолированных на косяки колоний и вычисляют статистические показатели: среднее арифметическое X, квадратическое отклонение σ и коэффициент изменчивости сv = σ·100/Х. Цель ступенчатого клонирования «стабилизировать» исходную культуру по количественному признаку.

ОТБОР СЛУЧАЙНЫХ (НЕПРЕДСКАЗУЕМЫХ) МУТАЦИЙ.

Метод осуществляется в несколько этапов и поэтому чаще называется ступенчатым отбором с применением мутагенов. Каждый этап заключается в следующем: исходная культура обрабатывается мутагеном, взятым в нескольких дозах, обеспечивающих разную выживаемость. Используют и несколько разных мутагенов. Из колоний, выросших после воздействия каждой отдельной дозой мутагена, отсевают не менее 100 колоний для дальнейшей оценки у них уровня продукции желаемого в-ва. Значения уровней продукции вариантов, полученных после обработки отдельной дозой мутагена, выражают в процентах по отношению к уровню продукции исходной культуры и распределяют в вариационном ряду. Полученные вариационные ряды сравнивают с контрольным рядом. выявляют плюс- и минус-варианты,. Плюс-варианты для дальнейшей оценки и выбора мутанта с повышенной продуктивностью. Затем плюс- варианты отбирают, оценивают в нескольких повторных опытах на способность продуцировать желаемое в-во, выбирают лучшие и проверяют их уровень продукции после 2-3 пересевов на агаризованной среде. Все проведенные опыты по проверке лучших вариантов суммируют,

11.Ауксотрофные мутанты. Отбор среди ревертантов ауксотрофов. Отбор среди мутантов, резистентных к структурным аналогам аминокислот или азотистых оснований. Отбор среди мутантов, резистентных к антибиотикам.

(Ауксотрофы – микроорганизмы, которые утратили способность синтезировать одно из в-в, необходимых для роста.) Использование ауксотрофных мутаций позволяет блокировать образование ингибитора или корепрессора синтеза желаемого продукта, перераспределить поток общих предшественников в путях биосинтеза, уменьшить или остановить дальнейшее превращение нужного продукта. Ауксотрофные мутанты получают с помощью мутагенов, применяя методы: метод обогащения, основанный на действии антибиотиков, на растущие в минимальной среде, т. е. прототрофные, клетки, а также метод реплик. У полученных ауксотрофных мутантов определяют питательные потребности, отбирают мутанты с той потребностью, которую хотели получить, и у последних оценивают способность продуцировать желаемое в-во. При этом питательная среда для ауксотрофа-продуцента должна содержать требуемый для роста метаболит в ограниченном кол-ве, так как в больш-ве случаев он подавляет синтез нужного продукта. Ауксотрофность не всегда вызывается блоком в пути синтеза; например, для аминок-т она может быть вызвана мутацией, нарушающей включение их в белки.

ОТБОР СРЕДИ РЕВЕРТАНТОВ АУКСОТРОФОВ, у которых ауксотрофность вызвана дефектом определенного фермента в пути синтеза метаболита, позволяет получить: 1)мутанты с восстановленной каталитической, но утраченной регуляторной функцией фермента, катализирующего синтез данного продукта, а также 2)мутанты с неполным восстановлением каталитической функции, т. е. снижением активности фермента по отношению к активности фермента прототрофного штамма или с усилением активности. Если ауксотрофность вызвана нарушением включения аминокислоты в белки, то ревертантов такого ауксотрофа восстановление способности может быть связано с мутацией другого гена, например кодирующего регуляторный фермент в биосинтезе данной аминокислоты. Такая мутация, нарушая регуляцию синтеза аминокислоты, вызывает ее сверхсинтез, чем и преодолевается ауксотрофность мутанта.

ОТБОР СРЕДИ МУТАНТОВ РЕЗИСТЕНТНЫХ К СТРУСТУРНЫМ АНАЛОГАМ АМИНОКИСЛОТ И АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЙ. - один из широко применяемых и эффективных методов получения штаммов продуцентов первичных метаболитов. Из числа различных структурных аналогов этих в-в наиболее пригодны для селекционных целей те, которые действуют на регуляторные системы синтеза подобно природному метаболиту, но не могут выполнить основной функциональной роли этого метаболита в клетке. (аналог аминок-ты, добавленный к клеткам, находящимся в минимальной среде, имитирует избыток этой аминок-ты на уровне систем, контролирующих ее синтез, но при этом не может заменить аминокислоту в белках вызывая голодание клетки по природной аминокислоте и останавливает рост) Добавление природной аминокислоты вместе с ее аналогом устраняет это голодание. В этих условиях клетка, прекратив синтез аминокислоты вследствие её избытка и присутствия аналога, использует внешнюю аминокислоту для жизнедеятельности. Способность аналога подавлять рост клеток и устранение этой способности в присутствии добавленного природного метаболита являются основой пригодности аналога для селекционной работы.

Для получения аналогорезистентных мутантов суспензию клеток исходной культуры после обработки мутагеном высевают в большой конц-ии (газоном) на чашки Петри с агаризованной минимальной средой, содержащей аналог в заранее подобранной конц-ии, ингибирующей рост исходной культуры. На чашках через несколько суток инкубации появляются колонии мутантов, преодолевающих действие аналога. Часть таких мутантов имеет мутации, нарушающие регуляцию синтеза желаемого метаболита и вызывающие его сверхсинтез, другая часть - мутации, нарушающие транспорт аналога в клетку, могут быть и др. мутации. Затем из каждой первичной колонии проверяют по 1-2 клона на способность продуцировать нужное в-во. У отобранного штамма определяют чувствительность к более высоким, чем ранее использованная, концентрациям аналога.

Основная причина, приводящая к сверхсинтезу – утрата чувствительности регуляторного фермента к ингибированию его конечным продуктом, а также нарушение механизма репрессии синтеза ферментов, что обеспечивает их неконтролируемый синтез. Сопутствуют и транспортные мутации, нарушающие поступление аналога и природного метаболита в клетку.

ОТБОР СРЕДИ МУТАНТОВ РЕЗИСТЕНТНЫХ К АНТИБИОТИКАМ применяют в селекции продуцентов антибиотиков. Различные антибиотики имеют разный механизм действия на микробную клетку: некоторые являются ингибиторами белкового синтеза, другие - мембранотропными или ДНК-тропными агентами. Многие антибиотики токсичны только для молодых культур продуцентов. Получают резистентные к антибиотикам мутанты без предварительной мутагенной обработки исходной культуры, а просто высевом суспензии спор или клеток на чашки с агаризованной средой, содержащей различные концентрации антибиотиков. Антибиотики могут индуцировать у выживших колоний появление морфологических мутантов, а также большую изменчивость по признаку антибиотикообразования. Эффективность действия антибиотика очень сильно зависит от особенностей штамма. В ряде случаев значительный эффект в селекции на повышение продуктивности получают с помощью собственного (выделяемого исходной культурой) антибиотика, в других - эффективно применение другого антибиотика. Селекцию с применением антибиотиков проводят в несколько этапов, постепенно повышая концентрацию препарата.

12.Способы длит. хранения микроорганизмов. Периодические пересевы ("Субкультивирование"). Хранение микроорганизмов при низких и ультранизких температурах. Лиофилизация. Высушывание. Хранение под минеральным маслом

Основные задачи хранения микроорганизмов - поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес. Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза (к торможению процессов обмена веществ).

ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПЕРЕСЕВЫ (ИЛИ «СУБКУЛТИВИРОВАНИЕ»).. Метод используется в различных лабораториях и необходим для микроорганизмов, которые не выдерживают замораживания или высушивания.

Пересевы культур микроорганизмов (главным образом аспорогенных) проводятся на свежие питательные среды 1-2 раза в месяц (иногда еженедельно); спорогенные бактерии, актиномицеты, дрожжи и мицелиальные грибы пересевают через 2-3 месяца. Культуры, находящиеся в начале стационарной фазы роста, лучше переносят условия хранения. Частые пересевы, особенно на жидкие среды, вызывают изменение свойств, способствуют возникновению спонтанных мутантов, которые могут снижать активность продуцентов биологически важных в-в. Для хранения используют генетически однородную популяцию на плотной среде (если они на ней растут). Микроорганизмы между пересевами хранят в темноте при температуре от 5 до 20 °С.

Низкие и ультранизкие температуры используют для длительного хранения бактерий, бактериофагов, мицелиальных грибов, дрожжей, микроформ водорослей, простейших.

Для хранения при низких температурах густые суспензии микроорганизмов в криозащитной среде, предохраняющей их от повреждений, разливают (1,0 мл) в стеклянные или пластиковые ампулы или пробирки с завинчивающимися пробками. В небольших лабораториях в качестве криоагентов наиболее часто используют смесь льда или снега с NaCl ( 3:1), имеющую температуру -21°С; смесь льда с СаС1₃ ( 2:1) -56°С; твердую углекислоту (-78 °С). Замораживание клеток ведется в сосудах Дюара. В рефрижераторах при температуре от -12 до -80°С. Для хранения микроорганизмов в крупных коллекциях используют рефрижераторы с азотом: газово-фазовый ( -130-170°С) и жидко-фазовый (-196 °С), рефрижераторы емкости от 10 до 35 л

В жидком азоте хранятся микроорганизмы, не выдерживающие лиофилизации (например некоторые автотрофные бактерии, спирохеты, различные вирусы). В жидком азоте лучше всего сохраняют стабильность признаков закваски (стартовые культуры) молочнокислых бактерий, а также тест-культуры бактерий и дрожжей, используемые для определения витаминов и антибиотической активности. Сохранение жизнеспособности микроорганизмов при замораживании и оттаивании зависит от природы организмов, возраста, плотности популяции, условий культивирования, криопротекторов, скорости замораживания - оттаивания и др.

Метод лиофилизации - высушивание клеток из замороженого состояния под вакуумом, минуя жидкую фазу (по типу сублимации). Используется в крупных коллекциях для длительного (более 30 лет) хранения бактерий, включая актиномицеты, микоплазмы, а также мицелиальных грибов, дрожжей, водорослей, простейших, вирусов, вакцин и плазмы, крови.

В процессе лиофилизации микроорганизмы подвергаются действию стрессов: замораживания, высушивания, регидратации и др.

Выживаемость лиофилизированных микроорганизмов зависит от специфической чувствительности вида и штамма, стадии роста культур, концентрации клеток, состава защитных сред, режима лиофилизации, условий хранения (температура, газовая атмосфера, свет), условий реактивации (состав и показатель активности воды, среды, продолжительность хранения).

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ. Лиофилизированные клетки лучше сохраняются под вакуумом или в атмосфере инертного газа (аргон, неон, гелий), чем на воздухе. Кислород оказывает токсичное действие. Лиофилизированные культуры желательно хранить при температуре 4-6°С, в темноте; при хранении на свету выживаемость их резко падает.

Кол-во воды, оставшейся после высушивания, влияет не только на жизнеспособность клеток непосредственно после лиофилизации, а также на скорость их отмирания во время хранения. Оптимум остаточной влажности (2-6%) Сверхвысушивание (ниже 0,5- 1,5% влажности) является губительным.

Высушивание - простейший метод хранения микроорганизмов. Многие микроорганизмы хорошо переносят длительное воздушное высушивание в природе (в почве, песке, глине) и в пищевых продуктах. Высушенные культуры микроорганизмов легко хранить и транспортировать.

В процессе высушивания происходит обезвоживание микробных клеток. В живых клетках вода составляет 80 - 90% массы. Во время высушивания клетки теряют свободную воду и рост микроорганизмов прекращается при остаточной влажности 12%. При снижении остаточной влажности до 5% сохраняется прочно связанная с клеточными структурами вода. В высушенных таким образом клетках биохимические реакции приостанавливаются или отдельные реакции протекают очень медленно.

Ряд микроорганизмов, переносит высушивание под вакуумом на сухих таблетках пептона, крахмала, на бумажных или желатиновых дисках.В производственной практике применяют методы контактной (с адсорбентом) и конвективной (в сухом воздухе) сушки для хранения хлебопекарных и кормовых дрожжей, заквасок молочнокислых бактерий, энтомопатогенных препаратов и др.

Метод применяется для сохранения крупных коллекций и в условиях лабораторий. Он отличается простотой, не требует специальной аппаратуры и обеспечивает относительно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности признаков большинства микроорганизмов различных систематических групп. Преимущества: обеспечивает относительно длительное сохранение стабильности свойств большинства микроорганизмов; сокращает время, необходимое для приготовления сред и пересевов; из одной пробирки можно отбирать инокулят несколько раз.

Недостатки: возможность инфицирования лаборатории и работающего персонала из-за разбрызгивания масла при обжигании петли. Требуется время для очистки от масла использованной посуды

Аэробные микроорганизмы выращивают в пробирках на поверхности коротко скошенной (под углом 45°) питательной агаризованной среды (5мл). Бактерии, растущие в анаэробных условиях, например пропионовокислые бактерии, сеют уколом в столбик агаризованной среды. При определении срока заливки культур маслом обращают внимание на образование у них покоящихся форм (спор, цист). Аспорогенные микроорганизмы лучше заливать маслом в начале стационарной фазы роста, а спорообразующие в стадии спор, актиномицеты и мицелиальные грибы 7-суточные, дрожжи 12-суточные.

Для хранения применяют высокоочищенное медицинское вазелиновое масло (плотность 0,9г/мл). Масло наливают не выше 1см над верхним краем среды. Более тонкий слой масла не предохраняет среды от высыхания. Микроорганизмы хранят при 5°С или при комнатной температуре в темноте.

13. Принципы термодинамики в биологических системах. Реакции окисления и восстановления с участием NAD⁺ и NADH⁺ .

Чтобы определить в каком направлении идут реакции в клетке используются принципы термодинамики. Для этого составляются элементарные реакции:

αА + βВ → γС + δD (1)

Изменение свободной энергии:

(2)

a, b, c, d – молярные концентрации веществ A, B, C, D. Все расчеты относятся к водным растворам рН=7. Это позволяет не включать концентрацию воды и Н⁺ в ур.2, даже если они участвуют в ур.1. Стандартное изменение свободной энергии означает изменение свободной энергии в ур.1 в нейтральном растворе, когда концентрация всех других реагентов и продуктов реакции равны 1 моль/л. Если концентрации не равны 1 моль/л рассматривается .

В закрытой системе реакция будет протекать →, если < 0, в состоянии равновесия =0. для равновесной реакции: (3). (4).

В биологических объектах реакцию можно провести только если > 0, добавив энергию АТФ (аденозинтрифосфат). Для этого должен пройти гидролиз АТФ→АДФ или АМФ с выделением неорганического фосфата P_i. . . Освободившейся монофосфат может присоединиться к органическому соединению с получением его фосфорилированной формы, которая выгодна клетке в путях превращения органических соединений.

Процессы в клетке не всегда можно считать изолированным и направление основного пути реакции в метаболизме не всегда можно установить путем изучения одной изолированной реакции.

Многие биологические реакции сопровождаются переносом электронов или протонов за счет работы окислительно-востановительных ферментов. В этом случае:

А_ox + B_red A_red + B_ox (5)

РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ С УЧАСТИЕМ NAD⁺ И NADH⁺.

При биохимическом окислении органическое вещество теряет электроны (понятия и Н⁺ эквивалентны) при восстановлении присоединяет. В таких реакциях учавствуют NAD⁺ (никотинамидадениндинуклеотид), FAD⁺ (флавинадениндинуклеотид), переходя в восстановленную форму NADН₂ И FADH₂.

NAD, FAD выполняют две основные функции:

1) аналогична функции ATP и заключается в переносе восстановленных эквивалентов, высвободившихся в ходе распада питательных веществ к биосинтетическим реакциям. Необходимость в восстановлении обусловлена тем, что степени окисления непосредственных продуктов биосинтеза не всегда соответствуют степени окисления веществ, необходимых для построения структурных элементов клетки. Восстановленные эквиваленты в наибольшей степени используются в процессах ассимиляции углерода, серы, азота из питательной среды.

2) и других родственных пиридиновых нуклеотидов связано с переносом електронов и протонов в дыхательной цепи при аэробном или анаэробном дыхании.