- •Бийский технологический институт (филиал)
- •Количественный учет микроорганизмов
- •Введение
- •1 Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом
- •1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского – Брида)
- •1.1.1 Приготовление препарата
- •1.1.2 Правила подсчета
- •1.2 Подсчет клеток в счетных камерах
- •1.2.1 Заполнение камеры и подсчет клеток
- •1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах
- •1.3.1 Приготовление фильтра
- •1.3.2 Правила подсчета
- •1.4 Метод микрокультур
- •2 Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды
- •2.1 Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха)
- •2.1.1 Приготовление разведений
- •2.1.2 Посев
- •2.1.3 Подсчет выросших колоний
- •2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)
- •2.2.1 Приготовление разведений
- •2.2.2 Посев и регистрация результатов
- •2.2.3 Примеры расчета Пример 1
- •Пример 2
- •3 Определение биомассы взвешиванием
- •3.1 Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения
- •3.2 Отделение микроорганизмов от среды
- •3.3 Определение биомассы
- •4 Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом
- •5 Практическая часть
- •5.1 Лабораторная работа № 1. Методы определения общего количества микроорганизмов в сыром молоке (6часов)
- •5.1.1 Определение общего количества бактерий в молоке методом посева
- •5.1.2 Подсчет микроорганизмов в мазках из молока методом Брида
- •5.1.3 Определение количества микроорганизмов в молоке
- •5.2 Лабораторная работа № 2. Методы количественного учета дрожжей (6 часов)
- •5.2.1 Метод Коха
- •5.2.2 Подсчет клеток в камере Горяева
- •5.2.3 Нефелометрический метод
- •5.2.4 Определение количества клеток дрожжей высевом в жидкие среды
- •5.3 Лабораторная работа № 3. Определение количества микроорганизмов в смыве с поверхности предметов. Санитарно-микробиологический контроль воздуха (6 часов)
- •5.3.1 Приготовление смывов
- •5.3.2 Микрофлора воздуха
- •6 Контрольные вопросы
- •7 Техника безопасности при выполнении лабораторных работ
- •Содержание
5 Практическая часть
5.1 Лабораторная работа № 1. Методы определения общего количества микроорганизмов в сыром молоке (6часов)
Цель работы:
Ознакомиться с различными методами бактериологического исследования молока по определению общего количества микроорганизмов.
Задания:
1. Провести бактериологическое исследование различных проб молока: приготовить разведения 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1: 100000 и сделать посевы на мясопептонный агар (МПА) в чашках Петри.
2. Подсчитать общее количество микроорганизмов в различных пробах молока (свежего и длительного хранения) методом Брида.
3. Определить количество микроорганизмов в молоке косвенным методом (редуктазная проба).
4. Сделать учет результатов, их оценку и занести полученные данные в протокол.
Оборудование и материалы:
– стерильные пипетки на 1, 2, 10 мл;
– пробирки;
– чашки Петри;
– восковые карандаши;
– предметные стекла;
– пробы молока (свежего и длительного хранения);
– биологические микроскопы;
– водный раствор 2%-ной метиленового синего;
– стерильный МПА;
– водяная баня;
– колбы емкостью 150-250 мл.
Методические указания по теме
О санитарно-гигиеническом состоянии молока можно судить по загрязнению его механическими примесями, по количественному содержанию бактерий, характеру микрофлоры, кислотности, наличию возбудителей инфекционных заболеваний и т. д.
Для определения содержания микроорганизмов в молоке обычно применяют следующие прямые (метод посева на питательные среды; непосредственный подсчет микроорганизмов под микроскопом) и косвенные методы (редуктазная проба).
5.1.1 Определение общего количества бактерий в молоке методом посева
Вначале готовят разведения (101– 106), для чего из отобранной пробы молока стерильной пипеткой берут 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (технику приготовления разведений см. в п. 2.1.1). Далее из разведений 104, 105 и 106 берут отдельной стерильной пипеткой по 1 мл суспензии, вносят в стерильные чашки Петри, а затем вносят 10 мл расплавленного и охлажденного до 50 ºС МПА. Суспензию с агаром перемешивают и чашки Петри с посевом помещают в термостат при температуре 30 ºС. После двухдневной инкубации подсчитывают колонии бактерий в чашках. Для подсчета общего количества бактерий в 1 мл общее количество колоний, выросших в бактериологической чашке, умножают на соответствующее разведение.
5.1.2 Подсчет микроорганизмов в мазках из молока методом Брида
5.1.2.1 На предметном стекле восковым карандашом наносят квадрат площадью 2×2 см (400 мм² ).
5.1.2.2 Микропипеткой в центр квадрата вносят 0,01 мл испытуемого молока и равномерно распределяют его в пределах квадрата, т. е. готовят мазок с известной площадью.
5.1.2.3 Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют и обезжиривают от 10 до 15 минут в спирт-эфире.
5.1.2.4 Мазок окрашивают 2...3 минуты водным 2%-ным раствором метиленовой синьки, промывают и высушивают фильтровальной бумагой.
5.1.2.5 Проводят расчет количества микробов, содержащихся в одном миллилитре испытуемого молока:
– определяют, сколько полей зрения придется на площадь мазка, учитывая, что площадь поля зрения иммерсионного объектива равна 0,02 мм². Для этого площадь мазка делят на площадь иммерсионного объектива 400 мм²: 0,02 мм² = 20000 полей зрения;
– определяют сколько микроорганизмов содержится в мазке, приготовленном из молока: среднее количество бактерий, содержащихся в одном поле зрения иммерсионного объектива, умножают на количество полей зрения, укладывающихся в мазке (20000 полей зрения);
– так как мазок приготовлен из 0,01 мл молока, то в 1 мл их содержится в 100 раз больше.