3.2 Отделение микроорганизмов от среды

В центрифужную пробирку наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чаще всего центрифугируют от 15 до 20 мин при 3…5 тыс. g. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной НСL на 1 л воды) и снова центрифугируют при том же числе оборотов. Супернатант сливают тотчас после остановки центрифуги. В противном случае часть осадка может быть потеряна.

Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтрованием. Бумажный фильтр помещают в стеклянную воронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры  от 5 до 10 мл. Осадок на фильтре многократно промывают подкисленной дистиллированной водой.

Для отделения бактерий используют мембранные фильтры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше величины клеток, биомассу которых определяют. Мембранный фильтр помещают на пористую пластинку специального держателя, вставленного в колбу. Чтобы ускорить фильтрование, установку подключают к водоструйному насосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной водой.

3.3 Определение биомассы

Чтобы определить массу сухих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же, что использовали и при определении массы пробирок или фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле:

М =

где М – сухая биомасса, г/л;

А – масса центрифужной пробирки (фильтра) с осадком, г;

В – масса центрифужной пробирки (фильтра) без осадка, г;

V – объем культуральной жидкости, взятый для центрифугирования (фильтрования), мл.

4 Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом

Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости.

В основе метода лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием света клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны света и т. д.), поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять число клеток по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной.

Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью нефелометра, фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале от 540 до 650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток минимальное. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к занижению результатов.

В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выражают в показателях нефелометра. Однако чаще строят калибровочные кривые между величиной светорассеяния и числом клеток или сухой биомассой в единице объема. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину оптической плотности суспензий с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых методов количество клеток или биомассу. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащихся в 1 мл суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую.