- •Бийский технологический институт (филиал)
- •Количественный учет микроорганизмов
- •Введение
- •1 Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом
- •1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского – Брида)
- •1.1.1 Приготовление препарата
- •1.1.2 Правила подсчета
- •1.2 Подсчет клеток в счетных камерах
- •1.2.1 Заполнение камеры и подсчет клеток
- •1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах
- •1.3.1 Приготовление фильтра
- •1.3.2 Правила подсчета
- •1.4 Метод микрокультур
- •2 Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды
- •2.1 Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха)
- •2.1.1 Приготовление разведений
- •2.1.2 Посев
- •2.1.3 Подсчет выросших колоний
- •2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)
- •2.2.1 Приготовление разведений
- •2.2.2 Посев и регистрация результатов
- •2.2.3 Примеры расчета Пример 1
- •Пример 2
- •3 Определение биомассы взвешиванием
- •3.1 Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения
- •3.2 Отделение микроорганизмов от среды
- •3.3 Определение биомассы
- •4 Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом
- •5 Практическая часть
- •5.1 Лабораторная работа № 1. Методы определения общего количества микроорганизмов в сыром молоке (6часов)
- •5.1.1 Определение общего количества бактерий в молоке методом посева
- •5.1.2 Подсчет микроорганизмов в мазках из молока методом Брида
- •5.1.3 Определение количества микроорганизмов в молоке
- •5.2 Лабораторная работа № 2. Методы количественного учета дрожжей (6 часов)
- •5.2.1 Метод Коха
- •5.2.2 Подсчет клеток в камере Горяева
- •5.2.3 Нефелометрический метод
- •5.2.4 Определение количества клеток дрожжей высевом в жидкие среды
- •5.3 Лабораторная работа № 3. Определение количества микроорганизмов в смыве с поверхности предметов. Санитарно-микробиологический контроль воздуха (6 часов)
- •5.3.1 Приготовление смывов
- •5.3.2 Микрофлора воздуха
- •6 Контрольные вопросы
- •7 Техника безопасности при выполнении лабораторных работ
- •Содержание
2.2.3 Примеры расчета Пример 1
Разведения исходной суспензии |
0 |
10-1 |
10-2 |
10-3 |
10-4 |
Число засеянных пробирок |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
Число пробирок, в которых обнаружен рост |
4 |
4 |
3 |
1 |
0 |
Числовая характеристика |
431 |
― |
― |
― |
― |
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов |
16,5 |
― |
― |
― |
― |
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии |
165 |
― |
― |
― |
― |
Пример 2
Разведения исходной суспензии |
102 |
103 |
104 |
105 |
106 |
Число засеянных пробирок |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
Число пробирок, в которых обнаружен рост |
3 |
3 |
2 |
0 |
0 |
Числовая характеристика |
320 |
― |
― |
― |
― |
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов |
9,5 |
― |
― |
― |
― |
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии |
9,5∙10³ |
― |
― |
― |
― |
3 Определение биомассы взвешиванием
Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологическим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании микроорганизмов на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.
Определение биомассы состоит из трех последовательных операций: доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения; отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; определение их массы. Чаще всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться определением сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить пустую центрифужную пробирку (фильтр), но не доводить ее массу до постоянного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.
3.1 Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения
С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри или центрифужные пробирки (не пластиковые!), помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение одного или двух часов при температуре от 80 до 85 ºС или от 90 до 100 ºС соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и быстро переносят в эксикатор с безводным хлористым кальцием (СаСL2) или концентрированной серной кислотой. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешивание. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют, соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее определениях не будут превышать десятых долей миллиграмма.