1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях. Фильтрование пробы известного объема (от нескольких миллилитров до литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.

1.3.1 Приготовление фильтра

Для фильтрования выбирают фильтр, размер пор которого позволяет задерживать микроорганизмы, находящиеся в субстрате. Перед использованием фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления воздуха и остатков растворителей; воду следует два или три раза сменить (кипячение не должно быть слишком бурным, иначе фильтры будут скручиваться). Затем фильтр помещают на специальный держатель матовой стороной вверх и пропускают через него точно измеренный объем пробы.

Чем больше плотность клеток в исследуемом материале, тем меньше должен быть исследуемый объем, и наоборот. Клетки микроорганизмов, осевшие на фильтре, окрашивают карболовым эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную красителем, чашку закрывают крышкой и оставляют на время от 3 до 5 часов или на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином. Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перестанет ее окрашивать. После отмывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопии. На предметное стекло наносят каплю иммерсионного масла, помещают на него окрашенный мембранный фильтр так, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность мембранного фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.

1.3.2 Правила подсчета

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммерсионным объективом 90 в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которые изложены для метода Виноградского – Брида. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

где М – количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;

а – количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);

s – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²;

F – площадь мембранного фильтра, мм²;

V – объем профильтрованной жидкости, мл;

10⁶ – коэффициент перевода [мм²] в [мкм²].

1.4 Метод микрокультур

Метод позволяет получить быстрый ответ о биологическом состоянии объекта. Для получения микрокультур в центр стерильного предметного стекла с начерченной миллиметровой сеткой площадью

5 см² наносят определенный объем (0,05 мл) разведенной культуры. Сюда же прибавляют две или три капли питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45 ºС, перемешивают ее с посевным материалом и размазывают по всей поверхности сетки. Полученный препарат накрывают покровным стеклом, кладут в стерильную чашку и ставят в термостат при температуре от 30 ºС до 37 ºС на 8 ч. Затем его вынимают, подсушивают и микроскопируют. Колонии можно подкрасить метиленовым синим Леффлера, разбавленным в соотношении 1:4. Окрашенный препарат снизу протирают, мазок накрывают покровным стеклом и подсчитывают колонии под микроскопом.