1. Фотореактивация

В 1949 г. А. Кельнер и в 1950 г. Р. Дульбекко установили, что жизнеспособность акти- номицетов и бактерий, подвергнутых УФ-облучению в летальных дозах, восстанав­ливается, если затем воздействовать на них видимым светом. Явление было названо фотореактавацией. Эффективность ее зависит от уровня pH, температуры и физио­логического состояния клетки. Восстановительный эффект при фотореактивации (рис. 10.1, а) связан с действием фермента —дезоксирибозидпиримидинфотолиазы, представляющего собой полипептид, ассоциированный для его активности с не­большой молекулой РНК (10-15 нуклеотидов). Этот фермент расщепляет димеры двух соседних пиримидинов циклобутанового типа в одной цепи ДНК, образующи­еся под влиянием УФ-лучей, действие которых подробнее рассмотрено в гл. 14. Ка­ждый из димеров задерживает репликацию примерно на 10 секунд. Фермент присо­единяется к ним и в темноте, и на свету, но реакция расщепления связей, объединя­ющих две молекулы пиримидинов, энергетически зависит от действия видимого света с большей длиной волны. На свету пиримидиновые димеры расщепляются, за счет разрыва ковалентных связей происходит мономеризация и таким образом вос­станавливается нативная структура ДНК. К эффективному диапазону (365-490 нм) относятся наиболее длинноволновые УФ-лучи (365-390 нм) и примыкающие к ним видимые синие лучи (435—495 нм). Наибольшая эффективность фото реактивации отмечена для голубой часта видимого спектра. Если же необходимо исключить воз­можность реактивации, то опыты следует проводить в более длинноволновой части спектра, начиная с желтого света (570—590 нм).

За 1 минуту молекула фотолиазы может расщепить 2,4 димера. У Е. coli система фотореактивации удаляет до 90% пиримидиновых димеров и контролируется одним геном - phr. Штаммы, несущие мутацию по этому гену не способны к репарации ДНК.

Фотореактивации подвергаются только циклобутановые димеры. Надо отметить, что это пока почти единственная, известная ферментная реакция, в которой факто­ром активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Дезокси- рибозидпиримидинфотолиаза широко распространена у разных органических форм и представлена даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Она есть у всех изученных бактерий, кроме Micrococcus radiodurans, которые чрезвычайно устойчивы кдействию УФ-лучей и выдерживают дозы в 1 ООО раз более высокие, чем те, что детальны для Е.соЧ. Фотолиаза обнаружена в клетках многих растений и жи­вотных, в том числе и у человека. По-видимому, наибольшее значение фотореакти­вация имеет у растений

2. Репарация днк за счет экзонуклеазной активности днк-полимераз

Установлено, что большинство бактериальных полимераз кроме 5'-3'-полимеразной активности имеют 3'-5'-экзонуклеазную активность, благодаря которой обеспечивает­ся коррекция возможных ошибок. Причем эта коррекция осуществляется в два этапа: сначала идет проверка соответствия каждого нуклеотида матрице перед включением его в состав растущей цепи, а затем — перед включением в цепь следующего за ним ну­клеотида. При встраивании неправильного нуклеотида двойная спираль деформирует­ся. Эго позволяет ДН К-полимеразе распознать в большинстве случаев дефект в расту­щей цепи. Если ошибочно встроенный нуклеотид не способен формировать водород­ную связь с комплементарным основанием, полимераза приостановит процесс репли­кации до тех пор, пока нужный нуклеотид не встанет на его место. У Е. соЧ обнаружен ген mutD, мутация которого изменяет е-субъединицу ДН К-полимеразы III, результатом чего является нарушение генетической репарации неправильно встроенных нуклеоти­дов, что в конечном итоге приводит к возникновению мутаций в других генах

ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК

Существуют системы генетической репарации, работа которых напоминает «хирур­гическое» вмешательство в структуру ДНК: поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК, отсюда происходит и термин «эксцизионная репарация» (англ. excision — вырезание). Сам феномен известен еще с 1955 г., однако, молекулярный механизм эксцизионной репарации был раскрыт гораздо позже — в 1964 г., в результате работ нескольких групп исследователей на линиях мутантных бактерий, чувствительных к действию радиации. Оказалось, что данный тип генетической репарации обеспечи­вает вырезание неверного или поврежденного нуклеотида/участка ДНК, последую­щую синтез застройку бреши и лигирование. К этому типу относится несколько спе­циализированных механизмов, например, гликозилазы удаляют лишь модифициро­ванные основания, АР-эндонуклеазы — апуриновые сайты, и тл. По-видимому, именно системы эксцизионной репарации восстанавливают большую часть повреж­дений ДНК в клетке.

Общая схема эксцизионной репарации, действующей по принципу «режь-ла- тай», включает несколько этапов (см. рис. 10.1, б):

1. Узнавание повреждения УФ-эндонуклеазой (у E.coli этот фермент называют UvrABC-эндонуклеазой);

В случае пиримидиновых димеров или моноаддуктов повреждение распознается легко. В других случаях, например, при неправильном спаривании нуклеотидов, оба нуклеотида (правильный и неверный) эквивалентны для многих видов эксцизион­ной репарации, однако существуют специализированные системы, позволяющие в большинстве случаев восстанавливать нативную структуру.

2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК этим ферментом по обе стороны от повреж­дения;

3. Эксцизия (вырезание и удаление) фрагмента ДНК, содержащего повреждение, происходит при участии геликазы — фермента, расплетающего молекулу ДНК для высвобождения концов после первичных надрезов;

4. Ресинтез, в ходе которого ДНК-полимераза I застраивает образовавшуюся брешь благодаря своей 5'-3'-полимеразной активности, а ДНК-лигаза ковалентно присоединяет З'-конец вновь синтезированного материала к ранее синтезированной ДНК.

Эксцизионная репарация ДНК завершается при возникновении ковалентных связей репарированного участка со скелетом полинуклеотида. Таким образом, обес­печивается непрерывность в ранее поврежденной цепи двухцепочечной молекулы ДНК. В целом, эксцизионная репарация обычно распознает нарушения вторичной структуры ДНК (двойной спирали) и вырезает их.

У Е. coli выделяют три вида эксцизионной репарации, различающихся по длине вырезаемых фрагментов поврежденной ДНК (короткие, длинные и очень короткие).

Эксцизионная репарация коротких фрагментов является конститутивной и конт­ролируются системой Hvr-генов (А, В, С, D). Размер вырезаемого фрагмента цепи ДНК составляет около 20 оснований. Комплекс UvrAB распознает повреждение (пи­римидиновый димер, моноаддукт), затем UvrA отсоединяется, a UvrC присоединяется, новый комплекс осуществляет разрез на 7 нуклеотидов в 5'-сторону от повреж­дения и 3-4 нуклеотида в другую. UvrD продуцирует геликазу, которая раскручивает ДНК для высвобождения концов цепей. Этап эксцизии обычно осуществляется ДНК-полимеразой I, которая помимо полимеразной имеет и экзонуклеазную актив­ность. Этот фермент, как правило, застраивает короткие участки (до 30 нуклеоти­дов). Д Н К-полимераза 11 способна вырезать и застраивать более длинные бреши (до 1 000-1 500 нуклеотидов). Такие же функции присущи экзонуклеазе VII. Таким обра­зом, отдельные этапы могут выполняться различными ферментами, что повышает на­дежность системы. Данный тип репарации ДНК удаляет примерно 99% моноаддуктов.

Эксцизионная репарация длинных повреждений контролируется той же системой генов, однако, является индуцибельной. Размеры вырезаемых фрагментов в отдель­ных случаях могут превышать и 9 000 нуклеотидов.

К специализированным системам эксцизионной репарации ДН К можно отнести эксцизионную репарацию очень коротких фрагментов. Она специфически удаляет Т в па­рах GT и СТ, используя продукты генов mutL и mutS. Другая система подобного рода, основанная на работе гена muiY, кодирующего аденингликозилазу, вырезает А в парах AG и АС. Эти системы могут работать очень успешно вскоре после синтеза ДНК.

ИСПРАВЛЕНИЕ ОШИБОК СПАРИВАНИЯ (МИСМЭТЧ-РЕПАРАЦИЯ)

Мисмэтч-репарация исправляет ошибки, возникающие в результате нарушения комплементарности пар АТ или GC в дочерней цепи при включении в них некомплементарных нуклеотидов. Особенность данного механизма, состоит в том, что он способен отличить «старую» цепь ДНК от «новой» и исправить именно вновь син­тезированную. В основе данного феномена лежит то важное свойство, что материн­ская цепь несет в последовательностях GATC аденины с присоединенными к ним сразу после окончания репликации метальными группами. Вследствие этого во вре­мя следующего цикла репликации материнская и дочерняя цепи становятся струк­турно различимыми, так как до окончания данного цикла дочерняя цепь остается неметилированной. Именно в этот временной промежуток и должны быть исправ­лены ошибки спаривания оснований. Генетическая репарация неспаренных основа­ний обнаружена в клетках и человека, и дрожжей. Механизм коррекции ошибок такого типа, базирующийся на сочетанном действии продуктов четырех генов mut (Н, L, 5 и (/) и получивший название «система MutHSLU», достаточно хорошо изучен у Е. coli. Такое взаимодействие протекает в несколько этапов, на первом из которых к паре некомплементарных оснований присоединяется MutS — белковый продукт ге­на mutS, распознающего нарушения такого типа (рис. 10.2). Соединившись с участ­ком, включающим неправильное основание, этот белок сразу же образует комплекс и с продуктом гена mutL. Сформированный трехчленный комплекс активирует про­дукт гена mutН (до этого момента находившийся в латентном состоянии) д ля связы­вания с ближайшей неметилированной последовательностью GATC. Обладающий эндонуклеазной активностью продукт гена mutH может разрезать дочернюю цепь как с 5'-, так и с З'-стороны от аденина. В первом случае к белку MutH присоединится экзонуклеаза, которая разрушит дочернюю цепь в направлении 5'-3' до места невер­ного спаривания и несколько дальше. А во втором — другая экзонуклеаза, с 3'-5'-ак- тивностью, двигаясь по дочерней цепи ДНК, также разрушит ее ошибочный фраг­мент. Дальнейший ход событий аналогичен описанным этапам ресинтеза и лигиро- вания концов в ходе эксцизионной репарации. Механизм коррекции, при котором восстановлению подвергается определенная цепь ДНК, называется направленным.

Эксцизионная репарация обнаружена как у простейших, так и в культуре клеток млекопитающих. В частности в культуре клеток здоровых людей после облучения ее ультрафиолетом через 20 ч из ДНК исчезает до 90% тиминовых димеров (со скоро­стью около 40 ООО димеров в час).

ПОСТРЕПЛИКАТИВНАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК

Пострепликативная репарация осуществляется в тех случаях, когда повреждение до­живает до фазы репликации (слишком много повреждений, или повреждение возни­кло непосредственно перед репликацией) или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации (например, сшивка цепей ДНК). Важная характеристика пострепликативной системы репара­ции - точность синтеза ДН К, не уступающая той, что наблюдается при обычной ре­пликации.

Эта система играет особенно важную роль у эукариот, обеспечивая возможность копирования даже с поврежденной матрицы (хотя и с увеличенным количеством ошибок). Одна из разновидностей этого типа репарации ДН К — рекомбинационная репарация.