Основные этапы и ферменты трансляции. Особенности процесса у эукариот.

Трансляция (от лат. translatio — перевод) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой.

Механизм

Синтез белка является основой жизнедеятельности клетки. Для осуществления этого процесса в клетках всех без исключения организмов имеются специальные органеллы — рибосомы. Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой и малой. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбуквенных (трехнуклеотидных) кодонов мРНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль молекулы мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК.[1]

Для узнавания аминокислот в клетке имеются специальные «адаптеры», молекулы транспортной РНК (тРНК). Эти молекулы, имеющие форму клеверного листа, имеют участок (антикодон), комплементарный кодону мРНК, а также другой участок, к которому присоединяется аминокислота, соответствующая этому кодону. Присоединение аминокислот к тРНК осуществляется в энерго-зависимой реакции ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами, а получившаяся молекула называется аминоацил-тРНК. Таким образом, специфичность трансляции определяется взаимодействием между кодоном мРНК и антикодоном тРНК, а также специфичностью аминоацил-тРНК-синтетаз, присоединяющих аминокислоты строго к соответствующим им тРНК (например, кодону GGU будет соответствовать тРНК, содержащая антикодон CCA, а к этой тРНК будет присоединяться только аминокислота глицин).

Механизмы трансляции прокариот и эукариот существенно отличаются, поэтому многие вещества, подавляющие прокариотическую трансляцию, в значительно меньшей степени действуют на трансляцию высших организмов, что позволяет использовать их в медицинской практике как антибактериальные средства безопасные для организма млекопитающих.

Процесс трансляции разделяют на

1. инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.

2. элонгацию — собственно синтез белка.

3. терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.

Рамка считывания. Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания. За некоторыми интересными исключениями, значимой является информация, закодированная только в одной рамке считывания. По этой причине крайне важным для синтеза белка рибосомой является её правильное позиционирование на стартовом AUG-кодоне — инициация трансляции.

Инициация. Синтез белка в большинстве случаев начинается с AUG-кодона, кодирующего метионин. Этот кодон обычно называют стартовым или инициаторным. Инициация трансляции предусматривает узнавание рибосомой этого кодона и привлечение инициаторной аминоацил-тРНК. Для инициации трансляции необходимо также наличие определённых нуклеотидных последовательностей в районе стартового кодона (последовательность Шайна — Дальгарно у прокариот и последовательность Козак у эукариот). Немаловажная роль в защите 5'-конца мРНК принадлежит 5'-кэпу. Существование последовательности, отличающей стартовый AUG от внутренних совершенно необходимо, так как в противном случае инициация синтеза белка происходила бы хаотично на всех AUG-кодонах. Процесс инициации обеспечивается специальными белками — факторами инициации (англ. initiation factors, IF; инициаторные факторы эукариот обозначают eIF, от англ. eukaryotes). Механизмы инициации трансляции у про- и эукариот существенно отличаются: прокариотические рибосомы потенциально способны находить стартовый AUG и инициировать синтез на любых участках мРНК, в то время как эукариотические рибосомы обычно присоединяются к мРНК в области кэпа и сканируют её в поисках стартового кодона.

У эукариот существуют два механизма нахождения рибосомой стартового AUG: кэп-зависимый (сканирующий) и кэп-независимый (внутренняя инициация).

При сканирующем механизме рибосома (точнее, её малая субъединица) садится на 5'-конец мРНК в области кэпа и двигается вдоль молекулы мРНК, «сканируя» один кодон за другим, пока не наткнётся на инициаторный AUG. Для привлечения рибосомы к 5'-концу мРНК требуется специальная структура, кэп — 7-метилгуанин, прикреплённый к 5'-концевому нуклеотиду мРНК.

При механизме внутренней инициации, называемом у эукариот также IRES-зависимым механизмом, рибосома садится на внутренний участок мРНК, называемый IRES (англ. Internal Ribosomal Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы) — участок мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой, позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG. По IRES-зависимому механизму инициируется синтез лишь на небольшой части клеточных мРНК, а также на РНК некоторых вирусов.

Также у эукариот возможна реинициация трансляции, когда после окончания трансляции рибосома с белковыми факторами не диссоциирует от мРНК, а перескакивает с 3' на 5' конец мРНК и начинает инициацию ещё раз. Такое возможно благодаря замкнутой кольцевой форме мРНК в цитоплазме.

Кэп-зависимый механизм. В отличие от прокариот, инициация трансляции у которых обеспечивается лишь тремя белковыми факторами, трансляция подавляющего большинства мРНК эукариот, содержащих 5'-кэп [m7G(5')ppp(5')N] и 3' поли(А)-хвост, требует участия, по крайней мере, 13 общих эукариотических факторов инициации (eIF), представленных 31 полипептидом. Инициация трансляции включает события между диссоциацией рибосомы во время терминации в предыдущем цикле трансляции и сборкой рибосомы, готовой к элонгации, на старт-кодоне мРНК. Во время инициации аппарат трансляции решает следующие задачи:

1. диссоциация и антиассоциация рибосомных субъединиц;

2. выбор инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAiMet);

3. связывание 5'-кэпа, связывание поли(А), сканирование;

4. выбор правильного старт-кодона;

5. объединение рибосомных субъединиц на старт-кодоне

Диссоциация и антиассоциация субъединиц рибосом Диссоциация рибосомных субъединиц в конце терминации — активный процесс, в котором участвуют eIF, а также факторы элонгации и терминации. Антиассоциация уже диссоциированных субъединиц обеспечивается eIF и служит для предотвращения преждевременного объединения рибосомных субъединиц.[3][4][Л 2][5] Главная роль в выполнении этой задачи принадлежит eIF3, мультисубъединичному фактору, состоящему из 13 различных субъединиц (общей молекулярной массой 800 кДа) у млекопитающих, 11 субъединиц у растений и шести субъединиц у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.[6][7] eIF3 связывается с 40S субъединицей рибосомы (40S) посредством своей j-субъединицы, которая, в свою очередь, взаимодействует с «каркасной» (scaffolding) b-субъединицей и предотвращает ассоциацию 40S с 60S рибосомной субъединицей (60S).[8][9] Эти активности eIF3 зависят от его взаимодействия с eIF1 и тройственным комплексом eIF2/GTP/Met-tRNAiMet.[10] Связывание eIF1 с 40S является кооперативным с eIF3[11][12], так же как и связывание eIF1 с eIF1А (гомологом бактериального IF1)[13]. Таким образом, eIF1А, вероятно, также участвует в антиассоциации, по крайней мере, непрямым образом

Cелекция инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAiMet) Этот этап включает в себя следующие процессы:

1. узнавание и метионилирование tRNAiMet специфичной метионил-тРНК-синтетазой;

2. дискриминацию против Met-tRNAiMet эукариотическими факторами элонгации;

3. дискриминацию против неметионилированной или неправильно аминоацилированной tRNAiMet eIF;

4. дискриминацию против элонгаторных тРНК eIF.

В ходе процесса (а), метионил-тРНК-синтетаза взаимодействует как с акцепторным концом тРНК, так и с антикодоном.

Процесс (б) у растений и дрожжей осуществляется с помощью посттранскрипционной модификации tRNAiMet, которая делает её отличной от элонгаторной метионин-специфичной тРНК с помощью присоединения 2'-О-фосфорибозила к рибозе нуклеотида А64. У позвоночных процесс (б) осуществляется путём дискриминации между специфическими особенностями нуклеотидных последовательностей tRNAiMet и элонгаторной метиониновой тРНК.

Элонгация. В процессе наращивания полипептидной цепи принимают участие два белковых фактора элонгации. Первый (EF1a у эукариот, EF-Tu — у прокариот) переносит аминоацилированную (заряженную аминокислотой) тРНК в А (аминоацил)-сайт рибосомы. Рибосома катализирует образование пептидной связи, происходит перенос растущей цепи пептида с Р-сайтовой тРНК на находящуюся в А-сайте, пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Затем второй белок (EF2 у эукариот, EF-G — у прокариот) катализирует так называемую транслокацию. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК на один триплет, в результате которого пептидил-тРНК оказывается вновь в Р-сайте, а «пустая» тРНК из P-сайта переходит в Е-сайт (от слова exit). Цикл элонгации завершается, когда новая тРНК с нужным антикодоном приходит в A-сайт

Терминация. Терминация — окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп- кодонов — UAG, UAA, UGA. Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке UAA или UAG; RF-2 — UAA или UGA. С UAA терминация эффективнее, чем с другими стоп-кодонами.

Основные виды рекомбинации, их характеристики, ферменты. Механизм гомологичной рекомбинации на примере модели Холлидея. Современный механизм гомологичной рекомбинации на примере модели двухцепочечного разрыва-репарации.

Комбинативная изменчивость имеет две основные составляющие: 1) случайное, равновероятное расхождение хромосом в мейозе (оно обеспечивает перекомбина- цию родительских хромосом и служит цитологическим обоснованием закона сво­бодного комбинирования, сформулированного Г. Менделем) и 2) рекомбинация сцепленных генов, локализованных в гомологичных хромосомах. В более узком смысле под рекомбинацией подразумевают перекомбинацию генов, и потому предпосылкой для нее, в частности, и для комбинативной изменчивости вообще, является гетерозиготность организма по одному или более генам. Эта гетерозигот- ность, а следовательно, и рекомбинация возникают у эу- и прокариот разными пу­тями: для их реализации у прокариот существуют конъюгация, трансформация и трансдукция, а также — совместная инфекция (у вирусов). У эукариот гетерозигот­ность обеспечивается диплоидностью генома, а сама рекомбинация может проис­ходить как в половых, так и в соматических клетках. Результатом рекомбинации в конечном итоге является перенос участков ДНК с одной молекулы на другую. В случае реципрокной рекомбинации этот перенос - взаимный, а при нереципрок- ной — односторонний.

Существуют два подхода к изучению процесса рекомбинации. Первый из них, классический, анализирует наследование признаков и, если признаки имеют тенден­цию наследоваться совместно, оценивает степень их сцепления, или частоту реком­бинации между соотве тствующими локусами (см. гл. 7). Этот подход возник в «домо- лекулярное» время и представляет собой статистический анализ наблюдаемого рас­хождения признаков при передаче их последующим поколениям. Второй подход к изучению генетической рекомбинации, молекулярный, направлен на анализ тонких механизмов этого процесса. Хотя для обоих подходов предметом исследования явля­ется один и тот же процесс, само понятие генетической рекомбинации неодно­значно.

Можно выделить три типа рекомбинации:

• общую (происходит между гомологичными последовательностями ДНК; это — рекомбинация между гомологичными хроматидами в мейозе, реже — в ми­тозе);

• сайт-специфическую (затрагивает молекулы ДНК, характеризующиеся ограни­ченным структурным сходством, и наблюдается при интеграции фагового генома в бактериальную хромосому);

незаконную (происходит во время транспозиции, не основанной на гомологии по­следовательностей ДН К

ОБЩАЯ, ИЛИ ГОМОЛОГИЧНАЯ, РЕКОМБИНАЦИЯ

Примером является мейотическая рекомбинация (кроссинговер) у эукариот, кото­рая происходит в клетках после репликации, в профазе первого мейотического деле­ния. Во время лептотены хромосомы конденсируются и становятся видимыми. В ка­ждой из них после репликации дуплексная ДНК представлена двумя сестринскими хроматидами. Под электронным микроскопом видно, что на стадии лептотены пара сестринских хроматид каждой хромосомы формирует единый осевой элемент. Уста­новлено, что у млекопитающих он состоит из белков SCP2 и SCP3 (от англ. synap- tonemal complex proteins). На следующей стадии, зиготене, гомологичные хромосомы начинают соприкасаться друг с другом (конъюгировать) на отдельных, пока еще ко­ротких участках. Одновременно осевые элементы гомологичных хромосом начина­ют соединяться попарно с помощью белка SCP1, который протягивается поперек между ними в виде субмикроскопических волокон (филамент). По завершении конъюгации, на стадии пахитены гомологичные хромосомы оказываются объеди­ненными в биваленты по всей длине за счет специфической структуры, состоящей из двух продольных белковых тяжей. Это - так называемые латеральные элементы, в состав которых входят осевые элементы с прикрепленными к ним, петлеобразно уложенными фибриллами хроматина сестринских хроматид. Латеральные элементы соединены между собой поперечными белковыми волокнами, которые в совокупно­сти формируют третью продольную структуру - центральный элемент. Из двух лате­ральных и одного центрального элемента образуется электроноплотная трехполос­ная структура, так называемый, синаптонемный комплекс (рис. 11.1), в котором гомо­логичные хромосомы прилегают к латеральным элементам с двух сторон, и этот кон­такт происходит «точечно» (в местах прикрепления петель к синаптонемному комплек­су по всей его длине). Функциональное значение этой структуры, напоминающей застежку «молнию», состоит в том, что, с одной стороны, она не дает конъюгирующим.хромосомам необратимо слипнуться, а с другой стороны — закрепляет их в строго гомо­логичном относительно локализованных на них генах взаиморасположении. В зависи­мости от размера генома у разных видов могут варьировать размеры синаптонемного комплекса: общая ширина его трехполосной ленты составляет от 76 до 240 нм, а длина соответствует также видоспецифичной длине бивалентов в профазе I мейоза.

На стадии диплотены гомологичные хромосомы бивалентов начинают расхо­диться, но обнаруживается, что несестринские хроматиды в биваленте остаются сце­пленными в некоторых точках, образуя фигуру, получившую название хиазмы. На стадии диакинеза хромосомы конденсируются путем спирализации, а хиазмы вследст­вие отталкивания гомологов начинают сдвигаться к краям хромосом. В этот момент все четыре хроматиды становятся видимыми. Эго — прямые наблюдения, и они позволяют сделать некоторые предположения о процессе рекомбинации.

Профаза первого деления мейоза - единственный момент, когда гомологичные хро­мосомы образуют комплекс друге другом, что, является условием, необходимым для осу­ществления рекомбинации. Можно полагать, что именно в обеспечении рекомбинации и состоит суть синапса - образование синаптонемного комплекса, временной структуры, которая формируется на стадии зигогены и разрушается в диплогене. Согласно мнению авторов приведенной выше гипотетической схемы, синаптонемный комплекс «...необхо­дим для организации хроматина в виде серии латеральных петель, основания которых со­браны в линейную последовательность на поверхности его латеральных элементов и до­ступны для узнавания гомологичных локусов и кроссинговера». Существует очень прав­доподобная, но до настоящего времени не всеми исследователями разделяемая гипотеза, что хиазмы представляют собой места прохождения рекомбинаций — ведь количество тех и других примерно совпадает. Это позволяет локализовать время происхождения процес­са рекомбинаций, и считать, что даже на стадии диакинеза в местах рекомбинации хро­мосомы все еще остаются связанными посредством нитей ДНК

МОДЕЛЬ ХОЛЛИДЕЯ

Наблюдая в микроскоп хиазмы, анализируя их строение, можно предположить, что процесс рекомбинации начинается с образования двух одноцепочечных разрывов в разных молекулах ДН К. Именно такую гипотезу высказал Робин Холлидей, предло­живший в 1964 г. стройную и изящную модель рекомбинационных процессов у эука­риот, основанную на принципе «разрыв-воссоединение пар гомологичных молекул ДНК». Согласно этой модели необходимым этапом рекомбинации яиляется конъю­гация, т.е. попарное сближение сестринских хроматид гомологичных хромосом с об­разованием взаимостабильных структур — бивалентов, при котором может происхо­дить обмен генетическим материалом.

Процесс обмена одноцепочечными участками между родительскими нитями ДНК состоит из нескольких этапов (рис. 11.2):

Формирование структуры Холлидея.

1. После репликации ДНК и, следовательно, удвоения хромосом, в ранней про­фазе мейоза наблюдается попарное сближение сестринских хроматид гомологичных хромосом с образованием бивалентов (т.е. конъюгация).

2. В каждой молекуле ДНК на двух сближенных гомологичных участках несест­ринских хроматид фермент никаза делает симметричные одноцепочечные разрезы.

3. Свободные концы цепей около разрывов отделяются от комплементарных партнеров и перебрасываются на бреши, образовавшиеся в гомологичных молекулах ДНК.

4. Концы переброшенных цепей лигируются с концами цепей реципиентных мо­лекул ДНК, при этом образуется крестообразная структура Холлидея с гибридным районом, гетеродуплексом. Таким образом, две претерпевшие рекомбинацию хромати­ды состоят в области концевых отделов из родительских цепей ДНК, а в середине - из участков, полученных от противоположных родительских молекул.

5. Центр структуры Холлидея, состоящей из двух полухиазм, может перемешать­ся вдоль спаренных цепей ДНК подобно замку застежки «молния», размыкая водо­родные связи между комплементарными основаниями внутри одной родительской молекулы ДНК и замыкая соответствующие связи между основаниями цепей из двух разных молекул ДН К. В результате такой миграции полухиазм в обеих родительских молекулах ДНК могут образовываться протяженные гетеродуплексные участки (у дрожжей зона гибридной ДН К достигает 1 ООО п.н).

Разрешение структуры Холлидея.

6. Структура Холлидея, состоящая из двух пар цепей (одна пара пересекающихся, дру­гая - непересекающихся), спонтанно и под котролем может подвергаться изомериза­ции. Чтобы восстановить биспиральную структуру обеих молекул Д Н К и таким образом закончить процесс их конъюгации, пересекающиеся цепи должны быть разрезаны. Еще одна изомеризация с поворотом одной из полухиазм вокруг точки перекреста на 180° приводит к образованию второй изомерной формы структуры Холлидея.

7. При разрезании полученного изомера по горизонтальной оси (в цепях, претер­певших обмен) две образовавшиеся молекулы ДНК не являются рекомбинантными по родительским маркерам (АВ и ab), фланкирующим область перекреста, но обе со­держат по гетеродуплексному участку.

8. При разрезании по вертикальной оси (в ингактных цепях) образовавшиеся ли­нейные молекулы рекомбинантны по родительским генетическим маркерам, распо­ложенным по обеим сторонам от гетеродуплексного участка ДНК.

Этапы 7 и 8 завершаются лигированием концов фрагментов, составляющих реком­бинантные и нерекомбинантные молекулы. Интенсивное изучение рекомбинации у бактерий сделало более понятной молекулярную организацию некоторых ее этапов. Установлено, что гомологичная рекомбинация у Е.соН контролируется генами гесА, В, Си D. Идентифицированы ферменты, являющиеся белковыми продуктами этих генов. Долгое время полагали, что ключевую роль в обеспечении всех процессов общей ре­комбинации у Е. coli играет белок RecA. Во-первых, он участвует в расплетании двой­ной спирали, способствуя конъюгации молекул ДНК, стабилизации свободных кон­цов и взаимодействию рекомбинирующих комплементарных цепей. Во-вторых, белок RecA катализирует переориентацию цепей с образованием структуры Холлидея и дальнейшей миграцией полухиазм. Вполне вероятно, что белок RecA в условиях его повышенной продукции непосредственно участвует в репарации, направляя рекомби­нацию между поврежденными и неповрежденными участками молекул ДНК. Накоп­ленные экспериментальные данные позволяют заключить, что промежуточным эта­пом рекомбинации у Е. coli также является формирование и разрешение структур Хол­лидея. Таким образом, модель, изначально предложенная для объяснения молекуляр­ного механизма рекомбинации у эукариот, казалась применимой и к прокариотам. Это позволяет предполагать значительное сходство процессов рекомбинации у тех и у дру­гих. Действительно, у дрожжей обнаруживаются гены, сходные с гесА.

Функции генов гесВ, гесС и recD стали проясняться лишь в последние годы. В на­стоящее время известно, что продукты именно этих генов играют ведущую роль в формировании свободных концов, т.е. именно они опосредуют начальный этап ре­комбинации. При этом каждая из трех субъединиц комплекса функционирует высо­ко специфично. Об этом свидетельствует тот факт, что мутанты гесВ, гесС и recD об­ладают разными свойствами: у штаммов гесВ и гесС резко снижена частота рекомби­нации и повышена чувствительность к ДНК-повреждающим агентам. Кроме того они характеризуются низкой выживаемостью. Все это свидетельствует об их неспо­собности репарировать повреждения ДНК путем гомологичной рекомбинации. Му­танты recD по выживаемости не отличаются от штаммов дикого типа, следовательно, рекомбинационный путь репарации у них не нарушен.

У бактерий получено много мутантов, неспособных к рекомбинации, и идентифици­ровано 10-20 соответствующих локусов. Очевидно, даже у прокариот рекомбинация представлена различными системами, которые контролируются специфическими гена­ми и функционируют в определенных условиях. Однако, во всех случаях, идет ли речь о традиционной рекомбинации, связанной с конъюгацией бактерий, или о рекомбинации, инициируемой повреждениями ДНК (как в случае пострепликативной репарации), или о рекомбинации с фаговым геномом, необходимыми предпосылками рекомбинации яв­ляются три момента. Это - образование одноцепочечного участка, образование свобод­ного З'-конца, а, кроме того, одноцепочный участок и свободный З'-конец должны быть в области гомологии одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.

МОДЕЛЬ ЖОСТАКА (ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ-РЕПАРАЦИЯ)

В частичном противоречии с логикой классической модели находятся и результаты, полученные на дрожжах Saccharomyces, свидетельствующие о том, что первоначальное событие, приводящее у них к рекомбинации, — это не одноцепочечный, а двухцепо- чечный разрыв в одной из хромосом. Принято считать, что любое повреждение, затра­гивающее две цепи (сестринские хроматиды) одной хромосомы чрезвычайно опасно, поскольку при отсутствии репарации может приводить к генетической нестабильно­сти, хромосомным перестройкам и гибели клеток. Однако двухцепочечные разрывы ДНК постоянно возникают в процессе нормальной жизнедеятельности клеток. У дрожжей они играют ключевую роль в инициации мейотической рекомбинации.

Последовательность событий, приводящих к рекомбинации в данном случае, бо­лее сложна, чем в модели Холлидея (рис. 11.4).

1-2. Вначале частичная деградация разорванных сестринских хроматид под дей­ствием экзонуклеаз приводит к образованию выступающих З'-концов.

3. Затем одна из цепей взаимодействует с несестринской хроматидой и замещает в ней такую же цепь, которая, в свою очередь, образует гетеродуплекс с оставшимся одноцепочечным участком. Область спаривания расширяется, дополнительный синтез восполняет утерянную

информацию.

3. В результате возникает

промежуточный продукт, со­держащий с обеих сторон от сайта двухцепочечного раз­рыва по две полухиазмы Хол­лидея. Кроме того, в его со­ставе есть два гетеродуплекс - ных участка.

3. Этот промежуточный продукт разрешается на ко­нечные продукты рекомби­нации под действием резоль- вазы, разрезающей полухиаз­мы либо в паре цепей, нахо­дящихся в точке перекреста, либо в интактной паре.

Пока не ясно, как свобод­ные одноцепочечные участки находят другие хроматиды.

Однако логически такой ход событий также может быть оправдан: сходные процессы должны протекать при репарации двухцепочечных разрывов. Первый контакт инициациирует сближение хро- матид и последующее образование синаптонемного комплекса. Основные этапы этой модели получили экспериментальное подтверждение. Многими исследователя­ми показано, что специфические двухцепочечные разрывы связаны с «горячими» точками мейотической рекомбинации. Тем не менее, отдельные аспекты остаются не вполне ясными. В частности, расположение гетеродуплексных участков ДНК в про­межуточном продукте на поздних стадиях репарации. Согласно описанной выше мо­дели Дж. Жостака, они должны формироваться за счет обеих хроматид-участниц ре­комбинации, но по разные стороны от сайта инициации. Однако в эксперименталь­ном материале тетрады (группы из четырех хроматид, равные паре гомологичных хромосом) с такой конфигурацией практически отсутствовали, зато был выявлен класс тетрад, не предсказываемый канонической моделью. Объяснение этому факту предложили Джилбертсон и Ф. Сталь. Согласно их модели (рис. 11.5), такое разре­шение промежуточного продукта возможно двумя способами.

Пассивное разрешение.

1. Вначале происходит расщепление одной (на схеме - правой) полухиазмы. При этом остаются незакрытыми два одноцепочечные разрыва.

2. Оставшаяся нерасщепленная (левая) полухиазма перемещается путем мигра­ции ветвей в сторону сохранившихся одноцепочечных разрывов.

3. По достижении их полухиазма пассивно разрешается. Продукты будут прояв­лять родительское сочетание маркеров, независимо от ориентации полухиазмы, ко­торая первой подверглась разрешению. Один из продуктов (именно он отсутствует в канонической модели Жостака) будет содержать гетеродуплекс.

Активное разрешение.

1. Под действием топоизомеразы, удаляющей супервитки, полухиазмы начинают сближаться. Это сближение достигает предельной степени (окружно­стью обозначена молекула топо­изомеразы).

2. На заключительном этапе топоизомераза разрешает два го­молога и формирует те же, что и в случае пассивного разрешения, продукты.

Идеи Джилбертсона и Сталя получили экспериментальное подтверждение. Однако следует заметить, что в сравнении с ка­нонической моделью рекомби­национной репарации и описан­ный выше вариант, и другие пред­лагаемые системы в плане репа­рации, по-видимому, малоэффек­тивны и работают только в отсутствие основного механизма. Тем не менее, детальное изучение молекулярных механиз­мов гомологичной рекомбинации уже сейчас позволяет с полной уверенностью утвер­ждать, что процессы генетической рекомбинации и собственно репарации двухцепо­чечных разрывов неразделимы. И потому термины «репарация двухцепочечных разры­вов ДНК», «рекомбинационная репарация», «рекомбинация» и «генная конверсия» (она будет рассмотрена дальше) достаточно часто используются в литературе для обо­значения одних и тех же процессов.

Частота рекомбинации в разных точках хромосомы может различаться, порой зна­чительно. Как правило, этот показатель ниже в гетерохроматиновых районах, особен­но — вблизи уже произошедшего обмена. Существуют «горячие» точки рекомбинации. У бактерий примером такой точки может служить chi-сайт — последовательность из 8 нуклеотидов (5'-GCTGGTGG), регулирующая экзонуклеазную и геликазную актив­ность гетеротримерного комплекса RecBCD. При достижении белком RecBCD chi- сайта производится разрез (т.е. фермент работает как экзонуклеаза), субъединица RecD высвобождается, а образовавшийся димер RecBC активно раскручивает спираль ДН К (т.е. функционирует как геликаза). По-видимому, основная функция вышеназванного фермента — создать одноцепочечный участок и свободный З'-конец.

Другой очевидный стимул для рекомбинации - образование одноцепочечной бреши в ДНК в результате репликации на матрице с повреждением. Брешь, естест­венно, образуется напротив дефектного участка. В этом случае возможна рекомби­нация с другой, вновь синтезированной хромосомой, не содержащей повреждения и, соответственно, бреши. Обычно для осуществления рекомбинации в подобном случае требуется дополнительный одноцепочечный разрыв в неповрежденной ДНК. Дальнейший этап рекомбинации связан с деятельностью белка RecA, который осу­ществляет ассимиляцию одноцепочечного участка (single-strand uptake or single­strand assimilation) — так называется процесс замещения одной из цепей ДНК в двух­цепочечной молекуле одноцепочечным участком. Этот процесс происходит всегда в одном направлении — 5' -> 3' по той цепи ДНК, комплементарная цепь которой за­мещается, именно поэтому нужен хотя бы один свободный З'-конец.

Если взаимодействуют между собой две двухцепочечные молекулы ДН К (одна из которых содержит одноцепочечный участок), то вытесненная цепь, в свою очередь, образует дуплекссДНКиз другой хромосомы, потерявшей своего партнера. Процесс вытеснения цепей продолжается с достаточно высокой скоростью - 10-20 нуклеоти­дов в секунду. В реализации этого важного этапа рекомбинации, участвуют продукты генов ruvA и В. Существующая структура не может быть постоянной, поскольку свя­зывает две различные молекулы ДНК. Разрешение этой ситуации возможно с помо­щью разрывов ДН К. В зависимости от того, какие цепи ДНК разрываются, образу­ется либо рекомбинантная структура, либо не рекомбинантная, но содержащая ко­роткие фрагменты гибридной ДНК в обеих хромосомах. Разрезание ДНК также осу­ществляется специальным белком, продуктом гена ruvC.