Конспект лекцій з курсу загальної біотехнології

(II семестр)

Основні закономірності та характеристики росту клітинних популяцій

1. утилізація субстрату (споживання);

2. утилізація кисню;

3. ріст клітин (розвиток);

4. інактивація клітин (в тому числі і відмирання);

5. утворення продуктів метаболізму.

Отримання сторонніх продуктів метаболізму – основні процеси схожі, але є деякі відмінності.

Основна задача будь-якого біосинтезу – отримання максимальної кількості продукту (незалежно від того продуктом є біомаса або метаболіти клітини).

Основне завдання – отримання оптимальних умов для розвитку клітин (оскільки в будь-якому випадку спочатку утворюється біомаса).

Швидкість розмноження та інтенсивність росту залежать від 3 основних величин (параметрів):

1. поживна цінність середовища;

2. фізико – хімічні умови культивування;

3. фізіологічний стан (вік);

Вік характеризується %-им вмістом популяції, яка знаходиться в певній фазі. Продуктами можуть бути як первинні (наприклад, органічні спирти і кислоти, біомаса) так і вторинні метаболіти клітини (наприклад, антибіотики, ферменти, амінокислоти).

Криві росту: МАЛ.

I. адаптація до поживного середовища;

II. фаза прискореного росту;

III. фаза експоненціального росту (культура адаптувалася і починає інтенсивно рости, має молодий вік і знаходиться в найбільш фізіологічно продуктивною та активованою). Цю фазу подовжують, щоб не утворювалися лімітуючи фактори (оскільки основними компонентами є вуглець і азот, то їх наявність буде забезпечувати ріст культури, тобто постійно додаючи їх ми подовжуємо цю фазу);

IV. стаціонарна фаза (вичерпуються поживні компоненти, всередині та ззовні накопичуються первинні продукти метаболізму);

V. фаза відмирання.

Диауксія: МАЛ.

Спостерігається при споживанні послідовно 2 поживних компонентів однієї речовини – джерела одного і того самого елемента (наприклад, глюкозу і лактозу).

Позначення: g – час генерацій, x – кількість біомаси, x₀ – кількість біомаси в той момент часу, який ми визначаємо.

,

де n – число генерацій.

Тривалість процесу:

.

Середня швидкість росту (характеризує весь процес взагалі):

.

Питома швидкість росту:

.

Одне з основних рівнянь кінетики мікроорганізмів: максимальна питома швидкість росту культури при необмеженій кількості субстрату (або майже максимальна):

,

де S – концентрація субстрату, що спостерігаємо, k_S – константа насичення (дорівнює концентрації субстрату при якій питома швидкість росту досягає половини максимальної).

,

р – концентрація продуктів метаболізму, µ₀ – питома швидкість росту культури при повній відсутності продуктів метаболізму, k_р – константа (дорівнює концентрації продуктів обміну (метаболізму) при якій питома швидкість знижується вдвічі).

Підбираючи р – підбираємо оптимальні умови.

Фізіологічна активність (метаболічний коефіцієнт) – це відношення концентрації спожитого субстрату за певний час віднесене до концентрації біомаси:

.

Чим нижча фізіологічна активність тим менш оптимальними є умовив середовищі; чим вища фізіологічна активність тим більш оптимальними є умови і тим вищим буде вихід продукту і біомаси.

Економічний коефіцієнт – відношення різниці концентрації біомаси до субстрату, який було спожито за цей час:

.

Економічний коефіцієнт показує – наскільки ефективно використовується субстрат.

Вихід біомаси з одиниці субстрату:

.

Кількість поділів клітини за одиницю часу:

.

Безперервне культивування. Особливості розвитку клітин:

1. проведення процесу в проточних умовах (відбувається постійний відбір культуральної рідини, нема лімітую чого фактору);

2. підтримання клітини в найбільш продуктивній фазі розвитку (лог або фаза стаціонарного розвитку);

3. постійне видалення продуктів обміну, які гальмують процес розвитку і біосинтезу.

Використовують в біосинтезі дріжджів, біомаси інших клітин, виробництво пиву етанолу, процес очистки стічних вод.

Моделі:

1. прогнозування розвитку (необхідно знати концентрації продуктів біомаси, залишкову концентрацію субстрату – в кожний момент часу);

2. підтримка концентрації розчиненого кисню, температури, споживання субстрату, перемішування взаємодіючих окремих продуктів біосинтезу.

Одним із способів (між періодичним і безперервним культивуванням) є культура повного витіснення (за рахунок зняття продуктів метаболізму – процес в часі і в просторі):

МАЛ.

Швидкість подачі мінімальна, в кожній секції – періодичний процес, а загалом безперервний (якщо не враховувати пристінні процеси), в кожній секції своя швидкість dv і :

.

2 варіант – повернення біомаси на початок (треба точно розрахувати фізіологію клітини, що входить і виходить). Реалізується в процесах очистки води.

Практичні моделі процесу безперервного культивування (на основі культури повного витіснення):

1. хемостат (МАЛ.);

2. турбідостат (МАЛ.).

Хемостат (постійний об’єм середовища – об’єм в даному випадку популяція) – це культура, в яку з постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище, постійно з розрахованою швидкістю відбирається культураьна рідина.

Враховують: V – культуральна рідина, τ – час, F – швидкість притоку.

F=V/τ – кількість середовища, яке надходить в апарат за певний момент часу (м³/год).

Контролюють:

1. фізіологічний стан популяції культури (чим частіше відбирають – тим більше поживних компонентів надходить в реактор, культура є більш молодою і фізіологічно активною);

2. чим частіше відбирають культуральну рідину, тим менше продуктів метаболізму в реакторі (нема інгібітору розвитку).

Швидкість розбавлення: D=F/V (год^-1), де F – швидкість притоку, V – повне поживне середовище.

Існує 3 варіанти розвитку процесу в реакторі:

μ=D – основна закономірність,

μ> D – культура старіє,

μ< D – вимивання культури.

Отримання екзогенних продуктів безперервним культивуванням мало використовується. Використовується в основному для отримання біомаси або ендогенних продуктів.

Продуктивність системи (за певний період часу): .

У хемостаті підтримується фіксація швидкості розбавлення, яка визначається експериментально і розраховується на максимальну концентрацію біомаси.

Область використання – дріжджові культури, мікроорганізми, які самі є продуктом.

Турбідостат – постійно підтримується оптична густина суспензії, як основний принцип (можливі варіанти). В основному контролюються стаціонарні показники – споживання субстрату, концентрація продукту й ін. Постійно автоматично регулюється оптична густина.

Обмеження у використанні актиноміцетів (бо мають міцелій), область використання – одноклітинні організми, культури, які не утворюють агломератів, плівок (щоб не були щільними).

Визначення кількості вуглеводів, що утилізує клітина:

1. за допомогою додавання в субстрат радіоактивної мітки (вуглець ¹⁴С);

2. математичний, із таких передумов: загальна кількість субстрату, що утилізується ΔS складається з кількості субстрату, що витрачається на клітинний розвиток (вуглець в складі біомаси) + кількість субстрату, який витрачається на енергетичний метаболізм:

ΔS= ΔS_с+ ΔS_Е

Економічний коефіцієнт:

Δх/ ΔS=Y, де Δх – кількість культури.

1/Y=1/Y_с+1/Y_Е

β Y_с= γ, де γ – кількість вуглецю спожитого субстратом, β – кількість вуглецю біомаси.

Енергетичні потреби клітини:

Y_Е=γ Y (γ-β Y).

Таким чином можна визначити умови культивування – чим більше економічний коефіцієнт по біомасі, тим ефективніше процес отримання продукту, використовується більше субстрату. Оптимізація – підбір умов, щоб загальний економічний коефіцієнт 1/Y був якомога більше, Y_с – менше, збільшення температури або інші умови, наприклад, pH і т. д.;

3. за допомогою використання розрахунку економічного коефіцієнту для енергетичних процесів (утилізація кисню на стехіометричних формулах) – лише для аеробних процесів;

4. за допомогою визначення кінцевих продуктів енергетичного метаболізму (потрібно знати фізіологію даної культури і за яким типом відбувається розщеплення субстрату). Розраховують кількість молекул і підставляють у рівняння, як утилізація вуглецю, і отримують кількість вуглецю у вихідній культурі – ідеальний економічний коефіцієнт.