Лабораторная работа №12. Разделение и идентификация аминокислот методами бумажной и тонкослойной хроматографии

Цель работы: провести идентификацию аминокислот А и В в смеси, определить на хроматограмме величины R_fА и R_fВ , степени их разделения Rs и числа теоретических тарелок N_А и N_В.

Оборудование: хроматографическая камера, капилляры, пластины марки «Sorbfil» с УФ-индикатором ПТСХ-АФ-В-УФ или ПТСХ-П-В-УФ или без УФ-индикатора. Пластинка для ТСХ «UV-Silufol» (Чехия) 12-15×5 см. Хроматографическая бумага 6×20 см. Сушильный шкаф либо промышленный сушильный пистолет. Подвижная фаза: смесь изопропанол – H₂O (об.%: I  70:30; II  50:50). Для определения положения пятен анализируемых веществ применяется реагент-проявитель  0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне. Дополнительно используются УФ-облучатель УФС-254/365, камера с парами йода, раствор КMnO₄ , спиртовой 5% раствор фосфорномолибденовой кислоты.

Анализируемые растворы аминокислот в подвижной фазе с концентрацией 1 мг/мл или модельные смеси в комбинациях:

для разделения методом БХ:

лизин-глицин-лейцин, глицин-пролин-лейцин,

лизин-валин-лейцин или двухкомпонентные смеси;

для разделения методом ТСХ:

аргинин-пролин-лейцин, лизин-пролин-лейцин, лизин-глицин-лейцин, аргинин-глицин-лейцин или двухкомпонентные смеси.

Выполнение работы. Разделение аминокислот выполняют методами одномерных восходящих БХ и ТСХ. Указанные методы с успехом применяют для разделения и обнаружения аминокислот в различных смесях. Ниже приведены формулы соединений:

Моноаминокарбоновые кислоты

Глицин CH₂(NH₂)COOH

Валин (СH₃)₂CHСН(NH₂)COOH

Лейцин (СH₃)₂CHСН₂СН(NH₂)COOH

Диаминокарбоновые кислоты

Лизин H₂N(СH₂)₃СН(NH₂)COOH

Аргинин H₂NC(=NH)NH(CH₂)₃CH(NH₂)COOH

Гетероциклические аминокислоты

Пролин

Подготовка хроматографической пластины. Вырезают пластину для ТСХ размером 3-5×6-12 см или кусок хроматографической бумаги 2-5×10-20 см. Снизу на расстоянии 0,5  1 см от края пластины карандашом проводят стартовую линию. На таком же расстоянии от левого края отмечают первую точку для нанесения пробы, расстояние между пробами на хроматограмме должно составлять около 1 см.

Приготовление элюирующей системы. С помощью мерных пипеток готовят 30-50 мл элюирующей системы. Для определения аминокислот в анализируемой смеси элюирование проводят в системе растворителей: смесь изопропанол – H₂O (об.%: I  70:30; II  50:50).

Хроматографирование. Бумагу и пластинку для ТСХ следует брать аккуратно за края, не касаясь её центральной части!

Нанесение образца на бумагу или пластинку для ТСХ. На линию старта с помощью капилляра наносят анализируемый раствор и растворы стандартных веществ. При этом необходимо прижать капилляр к бумаге или слою сорбента, раствор следует наносить так, чтобы капля не расплывалась (чем меньше диаметр капли, тем более четкой будет хроматограмма). Для более интенсивного испарения растворителя на нанесенные пробы можно направить поток воздуха комнатной температуры. Диаметр пятна не должен превышать 2-3 мм, а расстояние между пятнами должно быть не менее 7 мм. Пятно можно обвести карандашом.

Получение хроматограммы. После полного высушивания бумагу или пластинку помещают в специальную камеру с плоским дном для восходящего элюирования, в котором залита элюирующая система. Нижний край хроматограммы опускают в растворитель на 2-3 мм. Пятно не должно погружаться в растворитель, а пластинка не должна касаться стенок цилиндра. Элюирование прекращают в момент, когда линия фронта не доходит до края пластины около 7 мм. Время хроматографирования составляет несколько минут для ТСХ и 1,5-2 часа для БХ. После этого пластинку вынимают, отмечают на ней положение фронта растворителя и тщательно высушивают в токе сухого воздуха. Измеряют расстояние между стартовой линией и фронтом растворителя L. Затем по табличным значениям R_f и экспериментально найденной величине L вычисляют l  высоту подъема зоны каждой аминокислоты из заданной комбинации. Вычисляют величины Rs и α для двух аминокислот разделяемой смеси (рис. 6.1) по формулам 6.5 и 6.6 соответственно. Делают вывод о качественном составе анализируемой смеси и селективности разделения аминокислот.

Проявление. Обнаружение аминокислот. Большинство органических веществ образует невидимые зоны, поэтому для их обнаружения хроматограмму обрабатывают растворами органических и неорганических реагентов-проявителей (Табл. 2.1).

После высушивания пластинки ТСХ проявление пятен осуществляют с помощью раствора нингидрина. Нингидрин расщепляет α‑аминокислоту до альдегида, углекислого газа и аммиака, а сам восстанавливается до кетоспирта, который с аммиаком и избытком нингидрина образует краситель фиолетового цвета (фиолетовый Руэмана).

Рис. 2.2. Реакция α-аминокислот с нингидрином.

Пролин, у которого нет α-аминогруппы, в реакции с нингидрином образует производное желтого цвета. После обработки пластинки раствором нингидрина её подсушивают; при нагревании до 70-80^оС для проявления пятен на хроматограмме достаточно 3-5 мин. Рассчитывают величины R_f для каждого пятна. Затем по R_f и окраске пятен идентифицируют компоненты анализируемой смеси, используя данные табл. 2.4.

Таблица 2.4.

Величины R_f и окраска пятен аминокислот на хроматограмме при разделении их методами бумажной хроматографии (I) и ТСХ (II) (n = 5, P = 0,95)

Аминокислота	Rf			Цвет пятна
	I	II	I		II
Аргинин	-	0,070,01	-		Красно-фиолетовый
Лизин	0,10	0,080,02	Красно-фиолетовый		Сине-фиолетовый
Пролин	0,53	0,560,04	Желто-синяя		Сине-желтый
Глицин	0,35	0,630,06	Фиолетовый		Сине-фиолетовый
Лейцин	0,81	0,830,07	Фиолетовый		Сине-фиолетовый
Валин	0,66	-	Фиолетовый		-

Вычисляют величины Rs и α для двух компонентов разделяемой смеси (рис. 2.1) по формулам 2.5 и 2.6 соответственно. Оценивают величины N и H для каждой аминокислоты (рис. 2.1; формулы 2.3 и 2.4). Результаты заносят в таблицу 2.2.

Делают вывод о качественном составе анализируемой смеси, эффективности и селективности разделения аминокислот. Хроматограмму вклеивают в лабораторный журнал.