Методы выделения и количественного определения аминокислот
1. Амфотерные свойства α-аланина
Принцип реакции. Алании в водном растворе существует в форме биполярного иона и обладает кислотными и основными свойствами.
Материалы и реактивы. Водный 1 %-ный раствор α-аланина, 0,1 %-ный раствор соляной кислоты, подкрашенный индикатором конго в синий цвет (кислая среда), 0,1 %-ный раствор гидроксида натрия, подкрашенный фенолфталеином в розовый цвет (щелочная среда).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки со штативом, пипетки градуировочные, капельницы.
Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора α -аланина. В одну из них добавляют, перемешивая, по каплям раствор соляной кислоты до появления розово-красной окраски (щелочная среда). В другую пробирку, постоянно перемешивая, вливают по каплям раствор гидроксида натрия до исчезновения окраски (кислая среда).
2. Выделение свободных аминокислот из биологического материала
Принцип метода. Свободные аминокислоты извлекают из биологического материала 75—80 %-ным водным раствором этанола. Аминокислоты в вытяжке из биологического материала обнаруживают реакцией с нингидрином.
Материалы и реактивы. Сухой размолотый биологический материал (ткань экспериментального животного, фиксированная этанолом при нагревании и переведенная в сухой порошок), складчатые фильтры бумажные, 70 %-ный водный раствор этилового спирта, 1 %-ный водный раствор соляной кислоты, 1 %-ный раствор нингидрина в 95 %-ном ацетоне.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пипетки, ступка фарфоровая с пестиком, чашка выпаривательная, водяная баня, термометр лабораторный, воронки стеклянные, часы.
Ход работы. В ступку помещают 2 г размолотого сухого биологического материала и заливают 10 мл 75 %-ного раствора этилового спирта, нагретого до t 60—70 °С на водяной бане. Полученную смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через вставленный в воронку складчатый бумажный фильтр в чашку для выпаривания, используя ее в качестве приемника. Чашку помещают на кипящую водяную баню и полностью выпаривают спирт. Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл раствора соляной кислоты и тщательно его растирают стеклянной палочкой в течение 10-15 мин. Для обнаружения аминокислот в вытяжке к 5 каплям смеси добавляют 2 мл дистиллированной воды (разводят вытяжку) и 3-4 капли раствора нингидрина. Полученную смесь тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане при t 70 °С в течение 5 мин. Появляется сине-фиолетовая окраска, свидетельствующая о наличии в пробе α-аминокислот.
Если плотность окраски вытяжки с нингидрином измерить с помощью колориметра и сопоставить с плотностью окраски нингидрином смеси α-аминокислот известной концентрации, то можно рассчитать концентрацию α -аминокислот в исследуемой пробе.
3. Определение отдельных аминокислот хроматографическими методами Метод распределительной (радиальной) хроматографии на бумаге
Принцип метода. Применение метода распределительной хроматографии на бумаге для разделения аминокислот основано на различии в коэффициентах распределения отдельных аминокислот между двумя несмешивающимися жидкостями. Используемая в качестве инертного носителя хроматографическая бумага способна удержать в порах большое количество неподвижной жидкой фазы.
Коэффициент распределения Rf, определяемый как отношение расстояний, пройденных аминокислотой и подвижной фазой от точки старта, является характерной величиной для каждой аминокислоты в определенных условиях опыта (состав растворителя, температура, сорт хроматографической бумаги).
Положение аминокислот на бумаге определяют с помощью цветной реакции с нингидрином. В присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый, желтый или другой цвет (в зависимости от химической структуры аминокислоты).
Идентификацию аминокислот в смеси проводят по распределению известных аминокислот (стандартов).
Материалы и методы. Хроматографическая бумага, растворитель – смесь н-бутанола, уксусной кислоты, воды (4:1:1), смесь аминокислот и их стандартные растворы (0,1 %-ный растворы аланина, лейцина и глутаминовой кислоты), свежеприготовленный нингидриновый реактив (95 мл 0,5 %-ного раствора нингидрина в 95 %-ном ацетоне, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной воды).
Оборудование. Эксикатор или чашка Петри, пульверизатор, микропипетки, сушильный шкаф, карандаш, линейка, часы.
Ход работы. Хроматографическую бумагу вырезают в форме круга, диаметр которого равен поверхностному радиусу эксикатора (или чашки Петри). Простым карандашом круг разделяют на сегменты, в центре делают небольшое отверстие (0,5—1 см), в которое вставляют свернутую в трубочку фильтровальную бумагу (фитиль). Изменяя толщину и длину фитиля, который опущен в растворитель, регулируют скорость подачи растворителя на хроматографическую бумагу.
Карандашом у основания фитиля на хроматографической бумаге в каждом сегменте намечают точку нанесения аминокислот. На один из сегментов с помощью микропипетки наносят смесь аминокислот (5-10 мкл раствора аланина, лейцина и глутаминовой кислоты), на другой сегмент – такое же количество аминокислот стандартов. Затем хроматографическую бумагу высушивают на воздухе в течение 10 мин. В эксикатор (или чашку Петри) наливают растворитель – смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:1) в таком объеме, чтобы фитиль был погружен в растворитель. Круговую хроматограмму помещают в эксикатор (или между двумя половинками чашки Петри). Хроматограмма с диаметром 12 см образуется примерно через 1 ч, с диаметром 20 см – через 2 ч. После завершения распределения (фронт растворителя дошел до установленной отметки) хроматограмму высушивают и проявляют, опрыскивая нингидриновым реактивом из пульверизатора и прогревая в сушильном шкафу в течение 10 мин при температуре 110 оС
Сравнивая положение пятен смеси аминокислот с положением пятен аминокислот-стандартов, проводят идентификацию пятен смеси аминокислот. С помощью линейки определяют расстояния, пройденные фронтом растворителя и аминокислотами, и вычисляют значения коэффициента распределения.