4. Методы разделения и концентрирования

Упаривание

После той или иной стадии разделения следовый компонент почти всегда выделяют в виде раствора в относительно большом объеме растворителя. Очень часто возникает необходимость в концентрировании полученного раствора путем упаривания. Упаривание предлагается иногда даже в тех случаях когда оно явно может служить потенциальным источником погрешностей. Например, при получении летучих производных для определения вещества методом газо-жидкостной хроматографии упаривают реакционную смесь, остаток растворяют в небольшом количестве растворителя и полученный концентрированный раствор вводят в колонку хроматографа.

Упаривание осуществляют или в закрытой системе (дистилляция), или в открытом сосуде. В последнем случае повышается вероятность внесения загрязнений в процессе упаривания.

Для концентрирования растворов, содержащих сравнительно летучие компоненты, часто применяется специальный прибор Кудернн-Даниша, позволяющий упарить объем от нескольких сот мл до нескольких мл. Например, при использоввании этого прибора 100 мл гексанового раствора, содержащего несколько мкг пестицидов до объема 0,01 мл выход пестицидов составил 80-90% (в присутствии вспомогательного растворителя). Вспомогательный растворитель постоянно смачивает стенки сосуда, в котором производится упаривание, и т.о. способствует удержанию следового компонента в растворе.

П ри определении следовых количеств органических веществ упариванию должны подвергаться только низкокипящие растворители.

Для упаривания также применяют приборы с вертикальными трубками, которые служат дефлегматорами. Таким путем при упаривании 90% основного растворителя были выделены с выходом 90% мкг бензола (t кип. 80⁰С) применяют прибор для соединений с t кип. более 200⁰С.

Также используют упаривание растворителей при пониженном давлении.

При упаривании в открытых сосудах нагревание должно осуществляться, как правило, расположенным сверху внешним источником тепла, например, инфракрасной лампой. В качестве сосудов для упаривания применяют небольшие концен. колбы.

Очень часто возникает необходимость в высушивании раствора определяемого органического соединения в органическом растворителе. Для этой цели чаще всего применяют безводный сульфат натрия. Реже применяют высушивание методом отгонки азготропных смесей с водой.

Перегонка с паром и совместная дистилляция

Принцип, который лежит в основе метода разделения – совместной дистилляции (кодистилляции) заключается в том, что давление пара смеси двух несмешивающихся растворителей равно сумме давлений паров соответствующих чистых растворителей, поэтому температура кипения такой смеси ниже температуры кипения самого летучего из компонентов.

Кодистилляция, главным образом кодистилляция с водой (перегонка с паром), представляется собой метод отделения следовых количеств веществ, N-нитрозаминов, Q-углеводороды, фенолы в речной воде, ПХБ в ден. от лопс.

Перегонка с паром в ряде случаев, например, при отделении следовых количеств ДДТ от любых других материалов, оказываются более эффективной, быстрой, дешевой и безопасной, чем альтернативная методика разделения – экстракция гексаном. Иногда применяется перегонка с др. растворителями.

Перегонку с паром применяют для выделения следовых количеств веществ: фенолов (в воде), полихлорбифенилов (в донных отложениях), метанола в пищевых продуктах, пентахлорнитробензола (в овощах), углеводороды (в воде 8 трлн^-1), ДДТ (в почве, растениях), летучие нитрозамины (в воде). При применении этого метода следует предварительно убедиться в том, что летучий следовый компонент не разрушается при температуре отгонки (еще можно применить перегонку с паром при пониженном давлении).

Сублимация (1. Водяного пара – непосредственный переход водяного пара в лед, минуя фазу жидкой воды; 2. Возгонка – непосредственный переход вещества при нагревании из твердого в газообразное состояние, минуя жидкое состояние, например, сублимация льда).

Метод сублимации применяется в основном для очистки уже выделенных следовых компонентов, поскольку включенные в твердую матрицу в следовых количествах вещества обычно с трудом поддаются возгонке. Сублимацию используют для очистки и отделения полициклических ароматических углеводородов.

Также сублимацию используют для отделения определенных веществ от адсорбентов после тонкослойной хроматографии. Для сублимации следовый компонент конденсируют на охлаждаемом стержне, расположенном внутри закрытого сосуда непосредственно над обогреваемом образцом; при необходимости система вакуумируется. Для возгонки применяют небольшой стальной стержень  2 мм с отполированной торцевой поверхностью, которая может выполнять роль зеркала в ИК микроспектроскопии отражения.

Жидкостная экстракция

Жидкостная экстракция – распределение между двумя несмешивающимися жидкостями.

Жидкостная экстракция 1) не требует сложного оборудования; 2) выполняется достаточно быстро; 3) физико-химические принципы метода остаются неизменными в очень широком диапазоне концентраций разделяемых веществ; 4) практически полное отсутствие влияния составных частей матрицы.

Метод жидкостной экстракции является идеальным для предварительного разделения смеси на группы веществ с последующей (если необходимо) очисткой или с более тщательным разделением методами, основанными на др. принципах.

Жидкостная экстракция, особенно как стадия предварительного разделения, применяется для следующих целей:

• разделения смеси на группы веществ;

• перевода определяемого соединения в меньший объем с целью повышения его концентрации;

• перевода растворенного вещества в среду другого растворителя с тоем, чтобы провести реакции не осуществляемые в первом растворителе, или чтобы предотвратить нежелательные реакции, например, гидролиз.

Растворители, пригодные для выделения данного соединения выбирают эмпирически. Для этой цели обычно определяют коэффициенты распределения изучаемого соединения в ряде систем и затем выбирают систему с наивысшим коэффициентом распределения. Для выделения фосфорорганических пестицидов из твердых матриц, содержащих большое количество воды (фруктов, овощей), применяются полярные растворители, например, ацетон, этилацетат. Для экстракции образцов с большим содержанием жиров широко употребляется гексан.

Для жидкостной экстракции применяют конические пробирки или пробирки для центрифугирования, снабженные притертыми стеклянными пробками. При использовании пробирок равновесия можно достичь, несколько раз перевернув или слегка встряхнув пробирку. Центрифугирование способствует лучшему разделению фаз, а последующее отделение интересующей исследователя фазы может быть выполнено с помощью пипетки, или исприца, или отсасывающего устройства.

Р

1 – капиллярная трубка; 2 – слой органического растворителя; 3 – модифицированная мерная колба емкостью 1 л; 4 – проба воды

азработана аппаратура для экстракции из очень большого объема одной фазы, например воды, очень ограниченным объемом другого растворителя например гексана, в процессе выделения пестицидов из проб воды. В конкретном случае определения пестицидов осуществлялась экстракция 0,2 мл гексана из 980 мл воды. Наклоняя колбу и осторожно добавляя воду через боковое горло органическую фазу удается перевести в центральную часть колбы и затем вытеснить в капиллярную трубку, встряхивание вручную 2 мин.

Иногда применяют замораживание одной из жидких фаз с последующим ее отделением фильтрованием.

В некоторых случаях жестко обрабатывают вещества после их экстракцией органическим растворителем. Например, обрабатывают выделенные экстракцией нейтральные вещества дымящей серной кислотой. При этом менее устойчивые соединения разлагаются или сульфируются, превращаясь в более полярные соединения, а углеводороды и некоторые хлорированные пестициды не изменяются. Такой прием применяют при обработке выделенных экстракцией полихлорбифенилов и др. хлорированных соединений, например ДДТ.

Осаждение и соосаждение

Эффект разделения при осаждении достигается в результате образования одним или несколькими компонентами раствора малорастворимых соединений при введении в раствор соответствующих реагентов. При осаждении происходит отделение одного или группы веществ одновременно от матрицы и др. компонентов раствора, неспособных к образованию в данных условиях малорастворимых соединений.

Если в жидкой гомогенной системе происходит образование твердой фазы, то любой компонент образующий в данных условиях растворимые или малорастворимые соединения, но присутствующий в количествах, недоступных для образования собственной фазы, будет распределяться между осадком и раствором (или расплавом). Соосаждение можно рассматривать в двух аспектах:

• как нежелательный эффект, сопровождающий процесс осаждения и приводящий к загрязнению осадка

• как процесс направленного выделения микропримесей

Этот процесс лежит в основе самостоятельной группы методов разделения: собственно соосаждения (зонной плавки, направленной кристаллизации).

Осаждение и соосаждение используют не часто. Пример использования – нанограммовые количества аминов могут быть эффективно соосаждены вместе с тетрафенилборатом креатанина из 100 мл раствора.

Разделение с помощью мембран

1. Принципиальной основой диализа является способность веществ проникать через мембраны в зависимости от их молекулярной массы. Диализ часто является основным методом разделения в автоанализаторах. Диализ – один из лучших методов отделения связанных с белками веществ от низкомолекулярных соединений, как например, в случае определения в крови лекарственных препаратов, имеющих тенденцию к связыванию белками. С помощью мембран из корма для скота были выделены микотоксины в концентрациях порядка 3-4000 млрд^-1.

2. В ионообменных мембранах сочетаются свойства ионообменных смол и полупроницаемых мембран. Ионообменные мембраны позволяют отделять катионы от анионов или заряженные частицы от незаряженных молекул. Ионообменные мембраны значительно толще диализационных, поэтому скорость диффузии через них невысока и достигает значительных величин только в случае ионов небольшого размера. Такого типа мембраны имеют определенные преимущества в процессах обессоливания растворов. Ионообменные мембраны используют при удалении неорганических ионов из воды, после чего можно определить содержание органических веществ, например, мочевины в концентрации несколько млн^-1.

3. В методе «испарения через мембрану» водный раствор отделяют мембраной от вакуумированного пространства. Некоторые летучие органические соединения диффундируют через мембрану в это пространство, непосредственно соединенное с масс-спектрометром. Используют для определения ацетона, фенол, толуол, хлорбензол, нитробензол, нитротолуол, летучие ароматические углеводороды (моноциклические с заместителями до С₄). Мембраны могут быть из тефлона, полихлорэтилена, силик. резины.

4. Диазолиз – комбинированный метод, сочетающий принципы жидкостной экстракции и диализа. В этом методе две несмешивающиеся жидкие фазы разделяют мембраной, непроницаемой только для одного из находящихся в растворе веществ. Для диазолиза используют силиконовые мембраны. При диазолизе нет необходимости во встряхивании; обычно экстрагирующий растворитель медленно прокачивают через трубку, изготовленную из силиконовой резины и погруженную во вторую жидкую фазу. Таким путем из 1 л Н₂О несколькими миллиметрами толуола было выделено 50 нт ДДТ с выходом 85%. Диазолиз применяют для выделения и др. пестицидов.

Метод адсорбции на пузырьках газа и метод «отделения под слоем растворителя»

П од методами адсорбции на пузырьках газа подразумеваются различные приемы отделения растворенных или суспензированных веществ посредством их адсорбции или механического захвата поверхностью пузырьков газа, поднимающихся через слой жидкой фазы, которая содержит подлежащие разделению компоненты.

В анализе следовых количеств поверхностно-активных веществ применяется одним из вариантов этого метода, называемого методом «отделения под слоем растворителя». Этот метод заключается в пропускании тока воздуха через двухфазную систему этилацетат – вода. При этом поверхностно-активные вещества концентрируются на границе раздела фаз и могут быть определены вместе с органической фазой.

Электрофорез

П

Схема установки для капиллярного зонного электрофореза

ри электрофоретических способах разделения заряженные частицы или молекулы разделяют в электрическом поле в результате различия в их подвижности. Электрофорез оказался полезным при разделении ионизированных макромолекул.

Капилляр, в котором перемещаются зоны компонентов образца, помещают между двумя сосудами с раствором, проводящим электрический ток (обычно буферные растворы), и устанавливают между элементами разность потенциалов Е  2030 кВ.

Основные параметры, описывающие процессы в капиллярах при электрофорезе, аналогичны хроматограммам: время миграции частицы и эффективность разделения.

Эффективность разделения зависит от Е (р.п). Для повышения производительности обычно повышают напряжение и уменьшают длину капилляра.

Иногда для повышения эффективности разделения слож. смесей (белки, сыворотка крови и др.) капилляры заполняют гелями это приводит к уменьшению размыв. зон, уменьшению адсорбции частиц разделяемых веществ на стенках капилляров.

Примен.: определение биологически активных веществ, в т.ч. белков, токсинов, ядохимикатов и продуктов их метаболизма в растительных и животных тканях.

Изотахорез представляет собой вариант электрофореза, при котором компоненты смеси разделяют в соответствии с различиями в их результирующей подвижности.

При колоночном изотахорезе в качестве носителя используют полиакриламидный гель. К анализируемой пробе добавляют ионы-маркеры, смесь растворяют в замыкающем электролите, а колонку с полиакриламидным гелем заполняют ведущим электролитом.. при последующем приложении электрического поля происходит разделение компонентов смеси посредством их миграции между замыкающим и ведущим электролитами. По окончании процесса разделения образовавшиеся отдельные зоны компонентов смеси и ионов маркеров перемещаются с одинаковой скоростью в камеру для элюирования, где они и детектируются. Для изотахориза характерен концентрирующий эффект, и, как следствие, высокая разрешающая способность. Используют метод в анализе следовых количеств органических веществ и органических кислот – аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты.

Хроматографические методы разделения

Хроматографией называют процесс разделения, в котором данное соединение распределяется между подвижной фазой (жидкой или газообразной) и неподвижной фазой (твердой или жидкой на твердом носителе).

Газожидкостная хроматография – подвижной фазой является инертный газ (N₂, Hg, H₂). Пробу подают в виде паров, неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на твердый носитель. В качестве носителя используют кизельгур (диатолий) – разновидность гидратированного силикагеля; газохром Q, хромосорб W. Жидкая фаза должна быть термически устойчивой.

В газожидкостной хроматографии следовые количества определяемого соединения контактируют с граммовыми к… носителя (и неподвижной фазы), имеющими большую удельную поверхность. Поэтому разделение малых количеств веществ обычно сопровождается их потерей за счет адсорбции на носителе, причем потери тем выше, чем полярнее определяемое соединение. Используют специальную обработку неподвижной фазы с целью дезактивации адсорционных центров.

В газожидкостной хроматографии применяют капиллярные колонки  0,25 мм, изготовленные из нержавеющей стали, стекла или плавленого кварца, внутренняя поверхность которых покрыта тонким слоем неподвижной фазы. Очень высокой эффективности капиллярных колонок, обеспечивающих разделение сложных смесей, достигается благоприятными условиями обмена между подвижной и неподвижной фазами и отсутствие турбулентных потоков.

Недостатки капиллярных колонок – их малая емкость, не позволяющая анализировать пробы массой > нескольких микрограммов; анализ таких малых количеств требует наличия высокочувствительных детекторов – современные методы обнаружения обеспечивают требуемую чувствительность.

Капиллярные колонки обрабатывают пропуская через стеклянные колонки поток газообразного HCl, способствующего образованию на стенках капилляра мельчайших кристаллов NaCl, последние выполняют роль дополнительного носителя (можно использовать для обработки Na₂CO₃).

Газожидкостная хроматография на капиллярных колонках использовалась для определения 190 различных полициклических ароматических углеводородов, пестицидов, термически устойчивых гербицидов, различных загрязняющих веществ.

Чаще всего пробу в газожидкостной хроматографии вводят в колонку в виде раствора с помощью микрошприца.

Жидкость-жидкостная хроматография получила наибольшее распространение при концентрировании и разделении

В ее основе лежит распределение смеси соединений между жидкой фазой на твердом носителе (адсорбентом) и подвижной жидкой фазой.

В качестве адсорбентов используют полимерные смолы силикагель, оксид алюминия, целлюлоза. Главным образом, для отделения пестицидов сейчас используют силикат магния (флоризия). С помощью этого адсорбента из жировых тканей человека были выделены полибромбифенилы, концентрация которых вматрице составляет 10 млрд^-1.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии считается наиболее важным в анализе следовых количеств пестицидов, пищевых продуктов. Этот метод используют для разделения (определения) биогенных аминов, определения стероидов. Важной областью применения является химия окружающей среды, остаточных количеств веществ в продуктах и кормах.

В высокоэффективной (хроматографирование под давлением) используют колонки с внутренним  1-2 мм, позволяющие разделять 100 пг образца на неподвижной фазе с  частиц 10 мкм. Для прокачивания раствориеля через хром.

колонку используют насосы высокого давления.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии важно предохранять дорогие колонки от загрязнений. Растворы проб и растворители перед вводом в колонку необходимо фильтровать для чего применяют специальные фильтрующие патроны.

В ряде случаев при использовании селективных систем детектирования для анализа достаточно только суммарной фракции. В частности при определении ПАУ методом ВЭЖХ хроматографическую с внутренним  10 мм заполняют 10 г густой суспензии активированного силикагеля в гексане, а сверху помещают сдой из 2 г Na₂SO₄. Экстракт вносят в колонку и элюируют неполярные примеси 40 мл гексана. ПАУ выделяют элюированием 120 мл смеси гексан-дихлорметан (80 : 20).

В отличие от газожидкостной хроматографии этот метод пригоден для определения термически нестойких, нелетучих или очень полярных соединений, но в то же время высокоэффективная жидкостная хроматография может быть применена и для анализа тех веществ, которые обычно анализируют методом газожидкостной хроматографии. Теоретически ВЭЖХ имеет иного преимуществ, а ее недостаток – отсутствие универсальных детекторов типа пламенно-ионизационных.

Гель хроматография

Вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул. Неподвижной фазой в гель хроматографии является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной – сам растворитель, т.е. и подвижную и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна та же смесь веществ. Гель готовят на основе, например, декстрана, полиакрилимада или др. природных и синтетических соединений.

В процессе гель-хроматографии могут быть отделены крупные молекулы, которые гелем не морбируются, т.к. их размеры превышают размеры пор, от мелких, которые проникают в поры, а затем могут быть элюированы. Проводят и более тонкие разделения т.к. размеры пор можно регулировать, изменяя, например, состав растворителя, и как следствие, набухаемость растворителя. Гель-хроматография может быть выполнена в колоночном варианте и тонкослойном.

Практическое применение гель-хроматографии связано, главным образом, с разделением смеси высокомолекулярных соединений, хотя нередко они используются для разделения и нозкомолекулярных.

Гель-хроматография часто примен в анализе пестицидов, используется для анализа образцов, содержащих большое количество липидов (жиры, молоко), для определения летучих N-нитрозаминов в концентрациях порядка 0,6 млрд^-1 как предварительная стадия разделения.

С помощью гель-хроматографии проводят предварительную очистку «грязных» проб (экстракты почв, донных отложений, сточных вод и др.), что позволяет удалить многие высокомолекулярные соединения.

Тонкослойная хроматография ТСХ

В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В качестве неподвижной твердой фазе используют: оксид алюминия, силикагели. ТСХ на пластинках «Силуфол» применяют для определения афлатоксинов в зерновых, зернобобовых и молочных продуктах. Метод позволяет надежно обнаружить афлатоксины В₁ и G₁ на уровне 1-2 мкг/кг, а афлатоксины В₂, G₂ и М₁ – на уровне 0,5-1 мкг/кг.

ТХС на силуфоле обеспечивает также выделение ПАУ из органического вещества почв, донных отложений, растительного материала. В практических исследованиях, применяют подвижные фазы из смесей растворителей: для аэрозолей – смесь петролейного эфира и бензола в соотношении 8 : 2; а для почв и растений – сначала смесь бензола, этилформиата и муравьиной кислоты в соотношении 75 : 24 : 1, а затем смесь гектана, бензола и хлороформа в соотношении 2 : 4 : 4.

В 2…3 см от края пластинки на стартовую линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбрционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению.

Быстрее перемещаются хуже сорбирующиеся вещества. К достоинствам ТСХ относится также возможность двухмерной схемы разделения; пластинку последовательно обрабатываюь двумя растворами, подаваемыми во взаимно перпендикулярных направлениях. По окончании разделения возможны самые разнообразные способы идентификации и определения выделенных веществ от визуального обнаружения до точных измерений с помощью сканирующих денситометров. Иногда ТСХ применяют для предварительного разделения пробы в сочетании с др. методами; смесь разделяют в тонком слое сорбента на пластинке, а затем пятно, содержащее определяемый компонент, анализируют методами ВЭЖХ, ГЖХ или спектрометрии.

В тонкослой хроматографии на эффективность разделения и предел обнаружения влияет способ нанесения пробы на пластинку. Основным фактором при этом является размер пятна, который должен быть по возможности минимальным. Для нанесения пятен используют микрошприцы или капилляры или аппликаторы. Необходимое качество нанесения пробы по пластинке обеспечивают также так называемые концентрирующие пластинки; отличающиеся наличием в зоне нанесения узкого слоя инертного пористого силикагеля, отделенного от хроматографического слоя промежуточной зоной.

ТСХ используется для разделения токсинов и микотоксинов, гербицидов.

Схема выбора хроматографического метода

Определяемое соединение

мол.масса > 2000

мол.масса < 2000

Растворимые в органических растворителях

Водорастворимые

Растворимые в органических растворителях (гексане или меаноле)

Водорастворимые

неэлектролиты

электролииты

Гель-хроматография

Гель-фильтрация

Обычная или обращеннофазовая хроматография

Обычная или обращеннофазовая хроматография

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография (ИОХ) основана на обратимом стехнометрическом обменен ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника

позволяет разделять:

• катионы от анионов

• ионные вещества от неионных

• одноименно заряженные ионные вещества, различающиеся ионным радиусом или величиной заряда

Процесс ионообменного разделения осуществляется в хроматографической колонке, заполненной ионитом (катионитом при разделении смеси катионов и анионитом при разделении анионов), в которую через кран-дозатор подается элюент. Система детектирования, наиболее широко применяемая состоит из кондуктолибрического детектора и подавляющей колонки, устанавливаемой перед детектором и предназначенной для снижения фоновой электропроводности элюента.

Ионообменая хроматография обладает рядом достоинств – высокой чувствительностью, экспрессностью, селективностью. Недостаток – растворимость ионообменных смол в неводных растворителях (появляются фоновые сигналы).

Активно используется ионообменная хроматография в анализе объектов ОС: при анализе вод разного типа, в анализе почв, минералов, атмосферного воздуха используют для определения поверхностных активных веществ в концентрациях > 20 млрд^-1 из воды.

ИОХ применяют для эффективного выделения соединений, имеющих высокую полярность и соответственно хорошо растворяющихся в полярных растворителях.

например, ИОХ выделяют N-нитрозодиэтиламин в концентрации 0,1-0,5 мг/кг. ИОХ достаточно широко применяют для выделения ионов токсичных металлов, прежде всего радионуклидов. Так, с помощью анионита ВП-1АП выделяют плутоний из растворов 7-8 MHNO₃ . Предварительно для стабилизации плутония в виде Pu (IV) в раствор добавляют 250 г нитрита натрия на 100 г раствора.

Подходы к выбору хроматорграфических методов для решения задач анализа следовых количеств загрязняющих веществ систематически представлены на рис.

Схема разделения хлорорганических соединений (ХОС) на фракции

методом колоночной жидкостной хроматографии