3. Оплодотворение

Оплодотворение – вызываемое сперматозоидом побуждение яйца к развитию с одновременноц передачей яйцеклетке наследственного материала отца.

Дистантные взаимодействия гамет.

Дистантные взаимодействия – взаимодействия гамет при осеменении, осуществляющиеся до соприкосновения гамет. К ним относятся хемотаксис, стереотаксис и реотаксис.

Реотаксис – способность сперматозоидом передвигаться против тока жидкости в половых путях самки. Стереотаксис – способность двигаться по направлению к более крупному. чем сам сперматозоид, объекту – яйцеклетке.

К дистантным взаимодействиям можно также отнести реакцию капацитации сперматозоида, происходящую в половых путях самки. (1. Альбумины в половых путях самки связывают холестерин из мембраны сперматозоида, в результате чего уменьшается соотношение холестерин: фосфолипиды. Это приводит к дестабилизации акросомного пузырька. 2. Освобождение активных центров галактозилтрансфераз, ферментов, узнающих  N-ацетилглюкозаминовые остатки в молекуле гликопротеина, расположенного на поверхности прозрачной оболочки яйцеклетки и представляющего, по сути, рецептор сперматозоида).

Случаи хемотаксиса. Гиногамоны, андрогамоны, спермиолизины, их роль.

Хемотаксис – направленное движение сперматозоидов по градиенту концентрации веществ, выделяемых яйцеклеткой (аттрактантов). Хемотаксис встречается у многих групп животных, особенно беспозвоночных: кишечнополостных, моллюсков иглокожих, полухордовых. Примеры: у морских ежей – хемотаксические факторы пептидной природы (Strongulocentrotus purpuratus – 10-аминокислотный сперакт, у Arabica punctulata – 14-аминоксилотный резакт).

 Термин «Гамоны» предложен в 1940 нем. учёными М. Хартманом и Р. Куном. Вещества, выделяемые женскими и мужскими гаметами, названы ими соответственно гиногамонами и андрогамонами. Гамоны найдены у некоторых растений (водоросли, грибы) и многих животных (моллюски, кольчатые черви, иглокожие, хордовые).

В женских половых продуктах животных выявлены: 1) гиногамон I, усиливающий и продлевающий подвижность сперматозоидов; антагонист андрогамона I; низкомолекулярное термостабильное вещество небелковой природы. 2) Гиногамон II (фертилизин), вызывающий агглютинацию сперматозоидов. Согласно Лилли, он является необходимым звеном при соединении сперматозоида с яйцом, однако, по современным данным, его функция заключается в элиминации значительной части сперматозоидов, приближающихся к яйцу. У морских ежей фертилизин идентичен материалу студенистой оболочки и представляет собой гликопротеид; аналогичное по своему действию вещество имеется внутри яйца у морских ежей (цитофертилизин) и костистых рыб. 3) Вещество, инактивирующее агглютинирующее начало (антифертилизин яйца); у морских ежей осаждает гель студенистой оболочки и вызывает агглютинацию яиц; антагонист гиногамона II; белок.

В мужских половых продуктах животных найдены: 1) андрогамон I, подавляющий подвижность сперматозоидов; антагонист гиногамона I; низкомолекулярное термостабильное вещество небелковой природы. 2) Андрогамон II (антифертилизин сперматозоида), инактивирующий агглютинирующее начало; по действию сходен с антифертилизином яйца; относительно термостабильный белок. 3) Андрогамон III, вызывающий разжижение кортикального слоя яйца; низкомолекулярное термостабильное соединение (у морских ежей, по-видимому, ненасыщенная жирная кислота). 4) Лизины сперматозоида, растворяющие яйцевые оболочки; термолабильные белки (у млекопитающих — фермент гиалуронидаза).

Т.о., гамоны действуют как хемотаксические, рецепторные и литические агенты.

Контактные взаимодействия гамет.

Включают реакции активации сперматозоида и яйцеклетки, процессы слияния гамет (плазмогамии и кариогамии).

Активация спермия - акросомная реакция.

Реакция активации сперматозоида начинается при контакте его головки со студенистой оболочкой яйцеклетки. Контакт с гликопротеинами оболочки яйцеклетки вызывает открытие Ca2+ и Na + каналов.

1)В результате поступления ионов кальция в сперматозоид происходит слияние плазмалеммы с передней частью мембраны акросомы.

2)Раскрытие мембраны акросомы.

3)Выход протеаз из акросомы, лизис третичной (у млекопитающих – студенистой, zona pellucida) оболочки яйца.

4)В результате поступления Na+ из внешней среды в клетку, происходит отток H+ (через

Na+/Н+ - обменник), рН повышается и это приводит к взрывоподобному переходу G-актина в F-актин. В результате полимеризации актина задняя часть мембраны акросомы образует один (акросомная нить) или множество (акросомные микроворсинки) выростов.

Повышение pH также приводит к активации динеиновой АТФазы в шейке сперматозоида => повышение двигательной активности жгутика.

5) Взаимодействие биндина, встроенного в мембрану акросомной нити (бывшей внутренней мембраны акросомного пузырька) с рецептором на желточной оболочке яйцеклетки.

6)Лизис желточной оболочки яйцеклетки, образование бугорка оплодотворения.

У млекопитающих активация сперматозоида происходит без образования акросомного выроста. Диссоциация мембран сперматозоида и яйцеклетки происходит вдоль головки сперматозоида. Ферменты акросомы растворяют лучистый венец и сперматозоид вступает в контакт с блестящей оболочкой, которая образована белками ZP1-3. Контакт с ZP3 – 1 часть акросомной реакции. Затем изливается фермент проакрозин, который взаимодействует с ZP2 и лизирует блестящую оболочку. Возникает контакт задней мембраны акросомы и мебраны яйца, они сливаются с формированием единой наружной мембраны, ограничивающей канал, соединяющий две клетки.

Активация яйцеклеток - кортикальная реакция. Ее биохимические основы.

1)Моментом начала активации яйцеклетки считается образование бугорка оплодотворения.

Происходит благодаря полимеризации кортикального актина. Бугорок оплодотворения формируется после рецепции биндинов рецепторами желточной оболочки яйца.

2) Мембраны сперматозоида и яйцеклетки сливаются, образуется канал, по которому затем пройдут ядро и центриоль сперматозоида. В мембране сперматозоида, оказавшейся частью этого канала, находятся Na+ каналы, по которым натрий поступает в цитоплазму яйца. Мембранный потенциал яйцеклетки на несколько секунд меняется с -70 мВ на + 10 мВ => быстрый блок полиспермии. Это объясняется тем, что положительно заряженная мембрана яйцеклетки для сперматозоидов непроницаема (наличие потенциал-зависимых рецепторов).

3) При контакте биндина с мембранным рецептором яйцеклетки меняется конформация G-белка. Он активирует фосфолипазу С, которая также встроена в мембрану. Она расщепляет фосфатидил-инозитол-4,5-дифосфат(PIP₂) на диацилглицерол, DAG, (он затем через протеинкиназу С стимулирует транспорт Na⁺ внутрь клетки, H⁺ - наружу, что приводит к подъему синтеза белка в цитоплазме яйцеклетки и синтез ДНК в мужском и женском ядрах) и инозитол-3-фосфат (IP₃). Последний стимулирует выход Ca²⁺ из ЭПР. Кальций стимулирует экзоцитоз кортикальных гранул (альвеол) яйцеклетки (происходит кортикальная реакция). При этом в пространство между плазмалеммой и желточной оболочкой высвобождается ряд веществ:

1) вителлиновая деламиназа. Отделяет желточную облочку от плазмалеммы путем лизирования динеина, их соединяющего.

2) Спермрецепторная гидролаза лизирует сайты соединения налипших сперматозоидов, очищая от них поверхность яйца.

3) Осмотически активный гликопротеид, приводяший к поступлению воды в щель между плазмалеммой и желточной оболочкой => образованию перивителлинового пространства.

4) Фактор, способствующий затвердеванию желточной оболочки (теперь она называется оболочкой оплодотворения и становится недоступной для сперматозоидов). Медленный блок полиспермии.

5)Гиалин – структурный белок, участвующий в формировании гиалинового слоя, располагающегося у яйцеклеток некоторых видов над плазмалеммой.

Помимо этого, увеличение концентрации Ca²⁺ приводит к:

• активации синтеза белка (особенно гистонов и циклинов), ДНК (совместно с DAG)

• сборке и перераспределение элементов цитоскелета, в результате чего кортикальный слой приобретает сократимость, необходимую для дробления

• активация NAD-киназы (путем изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) => образование NADP => стабилизация оболочки оплодотворения (за счет синтеза липидов)

• активация кальпина II.

Фаза зрелости яйцеклеток различных групп животных при проникновении сперматозоида.

Мейоз завершается еще во время оогенеза у морских ежей и некоторых кишечнополостных.

У остальных видов происходит блок мейоза, который снимается только с оплодотворением.

1) Диакинез профазы I. Губки, плоские, круглые, кольчатые черви, моллюски, щетинкочелюстные, лиса, собака и лошадь.

2) Метафаза I - губки, немертины, кольчатые черви, моллюски, почти все насекомые.

3) Метафаза II – почти все хордовые. (У летучих мышей – анафаза II).

В состоянии метафазы II яйцеклетку удерживает белковый комплекс MPF, деградацию которого предотвращает циклин В. А его защищает от деградации pp39mos.

Поведение пронуклеусов и центриолей при оплодотворении.

Ионы кальция, попавшие в цитоплазму при активации яйцеклетки, активируют протеазу кальпин II. Последний инактивирует pp39mos, запускается обратный каскад, который выводит яйцеклетку из блока мейоза. Образуется зрелый женский пронуклеус.

При попадании в яйцеклетку сперматозоид разворачивается шейкой по ходу дальнейшего движения. Т.о., проксимальная центриоль (в яйцеклетку попадает чаще всего только она) занимает положение перед еще компактизированным ядром. На ней происходит сборка микротрубочек, что обеспечивает движение мужского ядра. В ядре, тем временем, лизируется ядерная оболочка, что предоставляет контакт между цитоплазмой яйцеклетки и хроматином. Под действием факторов цитоплазмы происходит замена протаминов на гистоны, что приводит к деконденсации хроматина. Теперь ядро называется мужским пронуклеусом.

Пронуклеусы сближаются, совершая «танец пронуклеусов». Сначала мужской пронуклеус движется внутрь яйца перепендикулярно поверхности – это «дорожка проникновения». Затем оба пронуклеуса движутся по «дорожке копуляции».

Синтез ДНК в пронуклеусах. Кариогамия.

Кариогамия – объединение хромосомных наборов пронуклеусов. Происходит только после завершения делений созревания яйцеклеткой.

При кариогамии или незадолго перед ней происходит репликация ДНК. Каждый пронуклеус – n2c. Кариогамия переходит непосредственно в первое деление зиготы. Центриоли веретена этого деления могут быть обе от сперматозоида, у некоторых видов – одна от матери, вторая от отца.

У животных, сперматозоид которых проникает в зрелую яйцеклетку, после кариогамии образуется интерфазное ядро зиготы. У остальных хромосомы выстраиваются в метафазную пластинку первого деления.

Определение пола при оплодотворении.

Определение пола при оплодотворении осуществляется на основании тех половых хромосом, которые достались зиготе и будущему организму от яйцеклетки и сперматозоида.

В таком случае есть два варианта определения пола:

1)в диплоидном наборе XX – ж,

XY (в редких случаях XO) – м.

То есть женский пол гомогаметен, мужской – гетерогаметен. Такое определение пола встречается у большинства млеков, амфибий, у нематод. моллюсков. иглокожих, большинства членистоногих.

2)У других видов гетерогаметен женский пол (ZW), гомогаметен мужской (ZZ). Птицы, пресмыкающиеся, тутовый шелкопряд.

Пол также может определяться не фактическим наличием Y-хромосомы, а соотношением X:аутосомы (у дрозофил). Чем больше Х, тем больше организм приобретает фенотип самки. Y хромосома на определение пола не влияет, но самцы без нее стерильны.

При оплодотворении осуществляется только хромосомное определение пола, тогда как существуют еще и генный (при различных мутациях гена SRY, например – при делеции участка с ним появляются XY женщины, при переносе на X или аутосому – ХХ мужчины) и геномный механизмы (у пчел), и некоторые другие.

Ооплазматическая сегрегация в разных типах яиц, ее морфогенетическая роль. Цитологические механизмы определения сагиттальной плоскости в яйцеклетке амфибий.

После проникновения сперматозоида начинаются процессы расслоения, отмешивания различных составных частей цитоплазмы яйцеклетки (ооплазмы) – ооплазматическая сегрегация.

стр.61-62

Намечается радиальная (относительно анимально-вегетативной оси) симметрия.

У амфибий желтый (где вошел сперматозоид) и серый серпы. Через их середину проходит сагиттальная плоскость симметрии.

Искусственный и естественный партеногенез. Гиногенез. Андрогенез. Теоретический интерес и практическое применение этих явлений.

стр.62-64 Развитие яйцеклетки без сперматозоида.

Стимулируется различными факторами: к-та/ температура итп. Которые похожи на реакции активации, идущие после контакта со сперм-ом. Обычно получаются диплоидные организмы.

Гиногенез: сперматозоид активирует яйцеклетку, но его ядро не участвует.

Андрогенез – развитие на базе мужского ядра и мужского пронуклеуса.

Экстракорпоральное оплодотворение у животных и человека.

Экстракорпоральное оплодотворение – оплодотворение вне организма матери. Формально этим термином можно обозначить наружное осеменение у многих групп животных (рыбы, амфибии и т.д.). Чаще термин ЭКО встречается как обозначение вспомогательной процедуры при бесплодии, в ходе которых слияние гамет отца и матери происходит in vitro, развитие зародыша до стадии 2-5 дней – в инкубаторе, а затем следует его имплантация в материнский организм.

Как правило, для экстракорпорального оплодотворения стараются получить несколько яйцеклеток, так как это повышает эффективность лечения бесплодия этим методом. Поскольку в норме у женщины в течение одного менструального цикла созревает одна яйцеклетка, то для получения нескольких яйцеклеток проводят так называемую процедуру «стимуляции суперовуляции». Для этого пациентке назначают инъекции гормональных препаратов (ФСГ, ЛГ, ХГ, ГнРГ). При достижении доминантным фолликулом определенного размера (16-20 мм) назначают процедуру извлечения яйцеклеток — пункцию фолликулов яичника. Полученную жидкость исследуют с помощью микроскопа для обнаружения яйцеклеток.

Обнаруженные яйцеклетки отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в лабораторную посуду с культуральной средой. В качестве лабораторной посуды используют чашки Петри, либо культуральные планшеты. Посуду с яйцеклетками помещают в инкубаторы, где они содержатся до оплодотворения. При невозможности получить яйцеклетки у пациентки (отсутствие яичников, менопауза и пр.) возможно использование донорских яйцеклеток (то есть яйцеклеток другой женщины). В качестве донора яйцеклеток может выступать бескорыстный донор (родственница, знакомая) или платный донор. Сперму пациент получает самостоятельно. В случае невозможности получения спермы путем эякуляции, используют хирургические методы: аспирация содержимого эпидидимиса, биопсия яичка и пр. Сперму получают в день пункции фолликулов супруги. Если получение спермы в день пункции невозможно, то используют предварительное получение спермы с последующим замораживанием и хранением в жидком азоте. Перед оплодотворением яйцеклетки сперматозоиды отделяют от семенной жидкости. Для этого проводят многократное центрифугирование спермы в культуральной среде.