2.5. Секвенирование днк

Современным методом определения нуклеотидной последовательности ДНК секвинирования ДНК является метод обрыва цепи. Прежде всего ДНК клонируют в фаге М1З, из которого легко выделяют однонитевую ДНК (а). Ее гибридизуют с короткой ДНК, называемой праймером, которая связывается с 3′ концом однонитевой ДНК (б). Затем к полученной матрице добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (d-НТФ), а именно, d-АТФ, d-ГТФ, d-ТТФ и d-ЦТФ. Кроме дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в реационную смесь добавляют один из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dd-НТФ). Затем с помощью ДНК-полимеразы ведут синтез второй (комплементарной ДНК). Остановка синтеза (обрыв цепи будет происходить всякий раз, когда вместо d-НТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему dd-НТФ. На схеме 3 принцип метода демонстрируется на примере с dd-ГТФ. В этом случае образуются фрагменты, которые включают праймер плюс 3, 6, 8, 13 или 14 других нуклеотидов Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из 4-х dd-НТФ (в). Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез (г). Длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи. Как только фрагменты ДНК визуализированы (д), нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очередностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных дорожках геля. Реальная электрофореграмма с четырьмя дорожками приведена на схеме 2, рис.2. При оптимальных условиях с помощью метода обрыва цепи можно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего 100-120 нуклеотидов.

Зная последовательность нуклеозидов в гене, соответствующий данному гену белок, а также генетический код легко усьтанавливается первичная структура белка, т.е. последовательность аминокислот в полепептидной цепи.

Аминокислоты кодируются триплетами нуклеозидов, например,

триплет ЦТТ кодирует аминокислоту фенилаланин,

ЦАТ – тирозин

ТЦЦ – аланин и т.д.