2.3. Полимеразная цепная реакция и амплификация фрагментов днк.

При нагревании ДНК до 90˚С двухнитевая молекула расплетается иобразуются однонитевые молекулы ДНК. Если в растворе при этом находятся в достаточном количестве все 4 нуклеозида (А, T, Г, Ц), то при охлаждении смеси на каждой однонитевой молекуле ДНК будут коплиментарно пристаиваться отдельные нуклеозиды (А всегда с, Г всегда с Ц), которые удерживаются на однонитевой молекуле за счет водородных связей, но между собой ковалентно не связаны. Сшивка отдельных нуклеозидов в полноценную молекулу ДНК осуществляется под действие термостабильного фермента – ДНК полимеразы, выделенной из термостабильных бактерий, живущих при температурах до 110̊С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК без помощи рестриктаз, векторов или клетки-хозяина. Для этого нужно иметь в своем распоряжении два олигонуклеотида (праймера), каждый из которых будет гибридизоваться с одной из цепей на противоположных концах подлежащего амплификации фрагмента ДНК, достаточное количество дезоксирибонуклеозид-трифосфатов и специальную термостабильную ДНК-полимеразу. Праймер синтезируют, а полимеразу получают из термостабильных бактерий

Н а первой стадии двунитевую ДНК нагревают до 90°С для разделения цепей и получения однонитевой ДНК (а). Затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация с праймерами (б). Комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров (в). Этот циклический процесс (цикл 1) повторяют с той же самой реакционной смесью (цикл 2, З и тд.) 20-30 - кратно. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Их количество удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами. Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате -амплификаторе с программируемым температурным режимом.

Амплификация фрагмента ДНК

2.4. Анализ длины рестрикционных

фрагментов

Рестриктазы расщепляют ДНК в специфичес-ких участках, обычно в палиндромных последователь-ностях. Когда одно из оснований в такой последо-вательности изменяется в результате мутации, этот участок перестает расщепляться рестриктазами. В то же время мутации могут приводить к образованию новых участков, чувствительных к рестриктазе. В результате соответствующие фрагменты ДНК, полученной от двух генетически не идентичных индивидов, образуют рестрикционные фрагменты различной длины. Это явление носит название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК

На рисунке приведен метод выявления ПДРФ.

Прежде всего, ДНК-фрагмент, содержащий исследуемую последовательность, амплифицируют с помощью ПЦР. Затем амплифицированный фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Фрагменты разделяют гель-электрофорезом, интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда. На рисунке приведены результаты применения метода в криминалистике. Рестрикционная карта образца ДНК, выделенной из ткани, найденной на месте преступления, четко совпадает с пробой, взятой у подозреваемого 2, а не у подозреваемого 1. для получения такого «генетического отпечатка» достаточно очень малого количества материала, содержащего ДНК. Вторым важным практическим приложением ПДРФ-анализа является выявление генетических мутаций, ведущих к наследственным заболеваниям.