1.Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала.

Процесс приготовления гистологического препарата состоит из следующих этапов: взятие и фиксирование материала, его уплотнение, приготовление срезов на микротоме, их окрашивание, заключение срезов в бальзам или синтетические смолы.

Взятие и фиксирование – максимальные размеры кусочков – 1*1*0,5см. фиксирующей жидкости не менее 1:9. Взятый образец ткани помещают в фиксатор: простой - спирт, формалин, раствор уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты или сложный – смеси простых фиксирующих жидкостей. Действие фиксаторов заключается в том, что удерживают клеточную структуру препарата в том состоянии, в котором их застигла смерть.

Уплотнение материала – цель данного этапа – уплотнить препарат настолько, чтобы из него можно было сделать срез. Применяют уплотняющие срезы – парафин(1-4 часа), целлоидин(1-3 недели), желатин, органические смолы или замораживание. Сначала препарат избавляют от воды с помощью спирта, затем избавляют от спирта с помощью бензола, ксилола или хлороформа. Из уплотнённого образца вырезают блоки и готовят тонкие срезы.

2. Техника изготовления гистосрезов, их окраска и заключение.

Приготовление срезов – самые тонкие (5-7мкм) срезы можно приготовить из материала в парафине. Из образцов в целлоидине срезы получаются толщиной 10-30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах. Срезы для эксперт-диагностики – на замораживающем микротоме.

Окрашивание срезов – срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для светового микроскопа. Методы окраски: красители бывают кислые (окрашивают оксифильные срезы), основными ( окрашивают базофильные срезы) и специальными (вытесняют конкретные структуры, обладающие сродством с ними) .Нейтрофильные срезы окрашивают как кислые, так и основные красители. Распространён комбинированный метод окраски гематоксилин+эозин. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, затем заключают между предметным и покровным стеклом в канадский бальзам или синтетические смолы.

3. Значение новых методов (цитохимия, гисторадиография, люменисцентная или электронная микроскопия) исследования для познания глубинных процессов жизни на клеточном и субклеточном уровнях.

Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.

Гистоавторадиография – или АВТОРАДИОГРАФИЯ (ауторадиография) — способ регистрации альфа- и бета-излучений, основанный на фотохимическом действии ионизирующих излучений. Для обнаружения радиоактивных изотопов фотографическая эмульсия приводится в соприкосновение с исследуемым материалом, в результате чего альфа- и бета-частицы вызывают почернение фотоэмульсии в виде линий (треков) по ходу пробега частицы. Альфа-частицы дают прямые широкие треки, бета-частицы — узкие неравномерные зигзагообразные полоски.

Люминесцентная микроскопия, метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами. Примером такого свечения являются известные всем лампы дневного света, в которых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - люминофор, покрывающий изнутри колбу лампы.

Электронная микроскопия — это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1—5 Å).

Действие электронного микроскопа (рис.) основано на использовании направленного потока электронов, который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).

Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз. В биологии и медицине в основном используются электронные микроскопы просвечивающего типа.